📚 课程目录第2章蛋白结构获取与预处理

2. 蛋白结构获取与预处理

在蛋白–配体体系的构建流程中，结构获取与预处理是决定后续参数化、对接或动力学模拟能否顺利进行的第一个关键环节。无论结构来自实验解析的 PDB，还是来自 AlphaFold 等预测模型，都很少能直接拿来就用。实验结构常存在缺失残基、缺失原子、无序区、非标准残基、缺失氢原子等问题；预测结构虽然序列完整，但侧链构象、质子化态、二硫键连接和末端状态同样需要检查与修正。本节围绕“拿到结构之后到底要做什么、怎么做、做到什么程度”展开。

一、结构来源与选择原则

结构来源主要有三类：X 射线晶体结构、冷冻电镜结构与 NMR 结构，以及 AlphaFold DB / AlphaFold2/3 等预测模型。选择时优先考虑分辨率、R 因子、配体是否共结晶、目标链是否完整、突变位点是否与实验一致。对于同一蛋白，若已有高分辨率共晶结构，通常优先使用实验结构；若目标区域在实验结构中大面积缺失，或需要研究突变体、同源蛋白，则 AlphaFold 模型是合理补充。

从 PDB 下载时，建议保留原始文件（如 1abc.pdb）与处理后的工作文件分开管理。AlphaFold 模型通常以 *.pdb 或 *.cif 提供，并附带 pLDDT 置信度信息。pLDDT 低于 70 的区域柔性较大，低于 50 的区域通常不应作为刚性对接或关键结合位点使用。

二、缺失残基与缺失原子的识别

缺失残基最直观的识别方式是检查 PDB 文件中的 REMARK 465（缺失残基）与 REMARK 470（缺失原子）。也可以按链逐残基比对序列编号，若出现编号跳跃，说明中间残基缺失。缺失原子则表现为某些残基只有主链 N、CA、C、O，而侧链原子不全。

处理策略取决于缺失位置：

远离结合位点、位于柔性 loop 的缺失，通常可保留缺口，不必强行建模；
位于结合口袋、活性中心或二硫键附近的缺失，应使用 MODELLER、SWISS-MODEL、FoldX 的 RepairPDB 或 AlphaFold 补全；
仅缺失侧链重原子时，可用 pdbfixer、pdb2pqr --ff=AMBER 或 reduce 补全；
缺失氢原子几乎总是需要补全，因为力场参数化与质子化态判断都依赖氢原子。

一个常用的命令行示例（示例参数，实际路径需替换）：

pdbfixer 1abc.pdb \
  --add-atoms=heavy \
  --add-residues \
  --ph=7.4 \
  --output=1abc_fixed.pdb

执行后应检查输出日志中 “Added N residues”“Added M atoms” 的数量，并与 REMARK 465/470 对照，确认补全范围合理。

三、二硫键与质子化态

二硫键由两个半胱氨酸的 SG 原子形成，是维持蛋白折叠的重要共价键。PDB 文件中通常以 SSBOND 记录给出。若结构来自预测模型，二硫键信息可能缺失，需要根据 SG–SG 距离判断：距离在 2.0–2.1 Å 之间通常可判定为二硫键；超过 2.5 Å 则需谨慎，可能是构象误差。

质子化态决定残基带电荷状态，直接影响静电相互作用与氢键网络。关键残基包括 His、Asp、Glu、Lys、Cys、Tyr。常用工具是 H++、PROPKA、PDB2PQR。以 PROPKA 为例，输入去氢结构，输出每个可滴定残基的 pKa 预测值。若 pKa 明显偏离标准值（如 His 预测 pKa 为 5.2），则在中性 pH 下应设为去质子化中性态；若 pKa 为 8.0，则应设为质子化正电态。

判断原则：在目标 pH 下，若 pKa > pH，残基倾向质子化；若 pKa < pH，残基倾向去质子化。组氨酸需特别关注，因其 pKa 常接近生理 pH，且不同互变异构体（HID/HIE/HIP）对氢键方向影响显著。

四、末端修补与整体检查

末端修补包括：补全缺失的 N 端氨基与 C 端羧基、封端（如 ACE/NME）、以及处理末端电荷。若末端暴露在溶剂中，通常保留带电末端；若末端靠近结合口袋，可考虑封端以避免非真实电荷干扰。对于截断的蛋白片段，封端几乎是必须的。

完成上述步骤后，应做一次整体检查：

链 ID、残基编号、原子命名是否规范；
是否存在原子重叠（clash），可用 MolProbity 或 reduce 检查；
所有可滴定残基的质子化态是否与目标 pH 一致；
二硫键是否被正确保留或重建；
水分子、离子、辅因子是否保留或删除，需与后续力场一致。

下面这张图概括了从结构获取到预处理完成的主要判断路径与处理对象，可作为操作时的对照参考。

五、实操检查清单

为便于直接执行，下面给出一份可填写的预处理检查清单。字段均围绕本节真实处理对象设计，不引入无关管理项。

检查项	判断依据	处理动作	完成标记
缺失残基	REMARK 465 / 编号跳跃	远离位点保留缺口；关键区用 MODELLER 补全	□
缺失原子	REMARK 470 / 侧链原子不全	PDBFixer 补重原子，reduce 加氢	□
二硫键	SSBOND 记录 / SG–SG 2.0–2.1 Å	保留或重建，检查是否被质子化误判	□
质子化态	PROPKA pKa 与目标 pH 比较	His 选 HID/HIE/HIP；Asp/Glu 去质子化	□
末端	N/C 端是否完整、是否暴露	补全或 ACE/NME 封端	□
整体 clash	MolProbity clash score	局部优化或重新建模	□

注意：质子化态与二硫键的判断必须在加氢之前完成，否则氢原子位置会误导 pKa 计算与 SG 距离判断。若使用 AlphaFold 模型，pLDDT < 70 的区域不建议直接用于结合位点分析，应先与实验结构或同源结构比对。

完成以上步骤后，结构才具备进入下一阶段参数化的基本条件。预处理的质量直接决定后续力场分配、电荷计算与模拟稳定性，因此宁可在此处多花时间核对，也不要带着缺失原子或错误质子化态进入参数化流程。