2. 序列数据库基础

做功能注释，说到底离不开数据库。你算法再牛，工具再新，最后比对的对象如果质量不行，结果就是垃圾。我见过不少新手，上来就怼BLAST，完全不管数据库里装的是什么。这其实挺要命的。

今天咱们就把这三个最常用的数据库讲透。不绕弯子，直接说清楚它们各自什么时候用、为什么用。

2.1 UniProt：蛋白质信息的"维基百科"

UniProt全称是Universal Protein Resource。我个人觉得，它是目前最权威的蛋白质序列和功能数据库。为什么？因为它有手工校验的部分。

UniProt主要分成两部分：

• Swiss-Prot：手工注释，质量极高。每条记录都有专家审核过。说白了，你拿它做参照，基本不会翻车。
• TrEMBL：自动注释，量大管饱。由EMBL的核酸序列翻译而来，没有人工审核。我项目中遇到过一个情况——用TrEMBL比对到一个"新功能"的蛋白，后来验证发现其实是自动注释搞错了。所以用TrEMBL一定要小心。

我们来看看记录长什么样：

ID   P01308_HUMAN              Reviewed;         110 AA.
AC   P01308;
DT   21-FEB-2001, integrated into UniProtKB/Swiss-Prot.
DT   01-JAN-1988, sequence version 1.
DE   RecName: Full=Insulin;
GN   Name=INS; ORFNames=ILPR, IRDN;
OS   Homo sapiens (Human).
OC   Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
OC   Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Primates; Haplorrhini;
OC   Catarrhini; Hominidae; Homo.
OX   NCBI_TaxID=9606;
SQ   SEQUENCE   110 AA;  11980 MW;  9C1B2D3E4F5A6B7C CRC64;
     MALWMRLLPL LALLALWGPD AAAAFVNQHL CGSHLVEALY LVCGERGFFY
     TPKTRREAED LQVGQVELGG GPGAGSLQPL ALEGSLQKRG IVEQCCTSIC
     SLYQLENYCN
//

注意那个"Reviewed"标签。嗯，这里要注意，只有Swiss-Prot的条目才标注了"Reviewed"。你做Pfam注释时，如果目标物种是模式生物，我建议优先用Swiss-Prot的序列。

wget ftp://ftp.uniprot.org/pub/databases/uniprot/current_release/knowledgebase/complete/uniprot_sprot.fasta.gz
gunzip uniprot_sprot.fasta.gz

2.2 RefSeq：NCBI的"官方精选"

RefSeq的全称是Reference Sequence Database。它由NCBI维护，特点是非冗余且经过人工审核。你想想看，一个物种的基因组那么大，如果不做筛选，数据库里就会塞满重复的、冗余的序列。RefSeq就是来解决这个问题的。

它的标识符格式很有规律：

• NM_：mRNA序列
• NP_：蛋白质序列
• XR_/XP_：预测的转录本/蛋白质

举个例子，你搜人类p53蛋白，会看到NP_000537.3。前面的"NP"告诉你是蛋白质，中间的"000537"是唯一编号，最后的"3"是版本号。说实话，这个版本号很重要。我以前吃过亏——用旧版本号做比对，结果发现序列已经更新了，后来不得不重跑所有分析。

RefSeq和UniProt有什么区别？看表：

2.3 NR数据库：BLAST的"大杂烩"

NR的全称是Non-Redundant Protein Database。名字叫"非冗余"，但它其实什么都装。你会问，它跟RefSeq不都是非冗余吗？

区别在这里：

• RefSeq：每个物种只选代表性序列，手工挑选。
• NR：把GenBank、RefSeq、UniProt、PDB等所有来源的序列合在一起，通过序列聚类去冗余。

说白了，NR是一个超级大仓库。它收录了来自所有物种的蛋白质序列，去掉了相似度极高的冗余拷贝。目前NR的规模大概在5亿条序列以上。你拿着一个未知序列去BLAST，NR是最能帮你找到远源同源物的选择。

但大也有大的问题。你看这个BLAST命令：

blastp -query my_protein.fa -db nr -out results.txt -evalue 1e-5 -num_threads 8

跑NR，即使开了8线程，一个中等长度的查询序列也需要半小时到几小时。为什么会这样？因为数据库太大，BLAST需要建立索引、逐条比对搜索，时间直接跟数据库大小成正比。

我在做宏基因组注释时，遇到一个场景：需要从海量短序列里找功能注释。如果用NR，服务器跑三天三夜都出不来。后来我换了UniRef90——也就是NR的90%相似度聚类版本——速度提升了10倍以上。有时候大而全不一定是好事。

2.4 三个数据库的协同使用策略

实际项目中，我从不会只依赖一个数据库。你想想看，每个数据库都有盲区。我的策略是这样的：

1. 快速判断：先用Swiss-Prot或UniRef90跑BLAST，5分钟内看有没有明显同源。
2. 深度挖掘：如果没结果，换NR，容忍更低的E-value（比如1e-3），找远源同源物。
3. 验证交叉：用RefSeq的NP_序列做交叉检查，看候选蛋白是否被NCBI官方注释为同一家族。
4. Pfam确认：最后用Pfam的结构域模型验证，确认序列确实包含目标结构域。

下面这张图展示了三个数据库在注释流程中的关系：

我个人最常用的组合其实是：先用NR做广谱搜索（因为NR基本能覆盖所有已知序列），然后拿Swiss-Prot交叉验证（确保不是自动注释的假阳性）。如果NR出来的结果跟Swiss-Prot对不上，我才会回头查RefSeq的基因组上下文。

嗯，说了这么多，其实核心就一句话：数据库选对了，注释成功了一半。我刚开始做注释时，把所有数据库混在一起用，结果BLAST跑了一周，里面有一半是内部冗余比对。后来学乖了，先理清每个数据库的定位，再根据项目需求选合适的。这才是正经专业的做法。