1. RNA-seq概述

各位同学好，我是老何。做 RNA-seq 分析有些年头了，踩过不少坑，也攒了些经验。今天咱们从最基础开始——把 RNA-seq 到底是啥、能干啥、该怎么设计实验，一次性说清楚。

我以前带团队时发现，很多人一上来就急着跑差异分析流程，结果样本分组不合理、测序深度不够，最后出来的基因列表根本没法验证。嗯，这里要记住：实验设计决定了分析质量的上限，后期再怎么调参数也救不了坏设计。

1.1 RNA-seq 的核心技术原理

RNA-seq 说白了就是把细胞里所有 RNA 分子“抄”一遍再数数。我们通过高通量测序仪把 RNA 反转成 cDNA 文库，然后读出一堆短序列片段（reads）。这些 reads 要么比对到参考基因组/转录组，要么从头组装，最后根据比对数量来估算每个基因/转录本的表达量。

我习惯把 RNA-seq 的技术流程拆成几个关键步骤：

• RNA 提取与质控——RIN 值低于 7 的样本我一般直接重做，不然数据噪声太大。
• 文库构建——包括 mRNA 富集（polyA 捕获或 rRNA 去除）、片段化、反转录、加接头、PCR 扩增。
• 测序——常用 Illumina 平台，读长 50-150 bp，单端或双端。
• 数据下机与预处理——fastq 文件里混着接头和低质量碱基，必须清洗。
• 比对/定量——STAR、Hisat2、Salmon 等工具各有优劣，后面章节会细讲。

1.2 RNA-seq 能解决哪些生物学问题？

这些年我见过 RNA-seq 应用最多的场景，大致可以归为三类：

我个人遇到最多的还是差异表达分析，这也是课程聚焦的核心。但别忘了——只在 p 值 < 0.05、log2FC > 1 画个火山图就结束？那大概率在浪费数据。我在项目里吃过一次亏：只关注 top 20 显著基因，结果忽略了一个低表达但功能关键的转录因子。后来我们开始结合功能富集和蛋白互作，才算把故事讲圆了。

1.3 实验设计——决定成败的隐形手

我见过太多人问：“老师，我只有两个样本，每个样本测 200M reads，能做差异分析吗？”每次听到这种问题，我心里都咯噔一下。RNA-seq 实验设计有几个硬指标，跑偏了后面全是白费力气。

1.3.1 生物学重复

• 至少 3 个重复，这是底线。我记得有位同行用 2 个重复跑 DESeq2，结果程序直接报错，因为离散度没法估计。
• 重复数越多，统计功效越大。但也要考虑成本，一般 3-6 个最常见。
• 技术重复（同一文库测多次）几乎没用，生物重复才能代表群体变异。

1.3.2 测序深度与覆盖度

• 差异表达分析：每个样本 10-30M reads 足够，再高边际效益递减。
• 可变剪接或新转录本：需要 50-100M reads 以上，因为要跨外显子覆盖。
• 双端测序比单端好，能提高比对准确性和剪接检测能力。

1.3.3 批次效应控制

这个坑我栽过：同一次实验分两次提 RNA、分两次建库，结果在 PCA 图上样本按批次聚类，组间差异全被淹没了。后来我定了个死规矩——所有样本的 RNA 提取、文库构建、测序必须在同一批次完成。实在做不到，就得在实验设计时做“批次平衡”（即每个处理组均匀分布在各个批次里）。

1.3.4 随机化与对照组

• 样本处理顺序、上机顺序都要随机化，避免系统偏差。
• 对照组必须是匹配的（时间、来源、性别等），否则差异分析结果毫无意义。

1.4 一张图看懂 RNA-seq 分析流程

下面这张 SVG 图我手绘了很久，把整个 RNA-seq 分析（从实验到差异结果）的核心路径画了出来。你在后面每个章节都会看到这张图的细化版本。

1.5 本章小结

RNA-seq 不是一个黑盒子——从实验到分析，每一步都有理可循。我们这节课重点就三个：

1. 技术原理：把 RNA “数清楚”，靠的是建库+测序+比对+计数。
2. 应用场景：差异表达最常见，但别忘了剪接、融合、新转录本等方向。
3. 实验设计：生物学重复、测序深度、批次控制、合理的对照组——缺一不可。