RNA-seq功能富集与通路分析工程 - 第1节

1. 课程简介与背景

1. 课程简介与背景：从差异基因到富集分析

这些年我一直在跟「差异基因」打交道。说实话，刚入行那会儿，我也跟很多人一样——拿到 RNA-seq 的差异基因列表，就急着去查每个基因的功能。 结果呢？几十上百个基因，挨个查完，花了好几天，最后跟老板汇报时，还是说不清楚「这堆基因到底在干嘛」。

后来我明白了。我们需要的不是单个基因的故事，而是这群基因背后的「共性逻辑」。 这就是本课程要讲的核心：差异 KEGG 与 GO 富集分析。 今天我们先聊聊：什么是差异基因分析？又为什么非得做富集分析？

1.1 差异基因分析：到底在找什么？

差异基因分析，说白了就是比较两组样本，找出哪些基因的表达量发生了显著变化。 比如正常组织 vs 肿瘤组织、用药前 vs 用药后。我刚开始做差异分析时，常被老板问：『你给了我一堆基因列表，然后呢？』 嗯，这时候要是没想清楚，很容易被问住。

常见的差异分析工具，我个人习惯这么选：

• DESeq2（R包）：适合小样本、基于负二项分布模型，稳定。我大部分项目都用它。
• edgeR（R包）：速度比 DESeq2 快，适合大样本或初步筛选。
• limma（R包）：原本为芯片设计，但也能处理 RNA-seq，且对数据质量要求高。

你拿到差异基因列表后，通常会得到这样一个文件：

GeneID    log2FoldChange    pvalue    padj
GAPDH     1.23              0.0001    0.002
TP53      2.11              0.0005    0.008
EGFR      -0.89             0.002     0.015
...        ...               ...       ...

但问题来了——这个列表里可能有几百个基因。哪个才是关键？它们之间有没有联系？这时候就需要富集分析登场了。

1.2 为什么要做富集分析？把「点」串成「线」

你想想看，如果只盯着一个基因，很容易被它的个别功能带偏。比如 TP53 跟细胞凋亡相关，但你的差异列表里还有 DNA 修复、细胞周期、代谢相关的基因。 它们可能共同指向某个更大的生物学问题。

富集分析就是做这个的：判断一组差异基因是否在某个已知的「通路」或「功能分类」中显著富集。 我曾经在一个肝癌项目里，差异基因列表里既有炎症因子又有代谢酶，单个看都不突出。但一跑富集分析，发现「脂肪酸代谢」和「IL-17 信号通路」两个类别富集度极高，一下子就抓住了重点。

1.3 GO 与 KEGG：两大法宝

做富集分析，最常用的就是 GO（Gene Ontology） 和 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）。 很多人问：两者有什么区别？我一般这么解释：

维度	GO	KEGG
本质	描述基因的「属性」	描述基因参与的「分子交互网络」
分类	BP（生物过程）、CC（细胞组分）、MF（分子功能）	信号通路、代谢通路、疾病通路
数据更新	社区维护，更新频繁	KEGG 官方维护，较稳定但更新慢
适合场景	探索基因的生物学功能倾向	寻找参与的具体信号通路

我记得有一次做免疫治疗相关的肿瘤数据，差异基因 GO 富集显示「免疫系统过程」显著，但 KEGG 富集却只找到了几条代谢通路。 为什么会这样？因为 GO 更宽泛，而 KEGG 通路的注释范围受限——很多免疫相关基因当时还没有被收录到 KEGG 通路里。 所以我的建议是：两种都用，但别只盯着P值最小的那个。

1.4 差异基因 → 富集分析 → 生物学解释

来个直观的图，你就明白这整套流程是啥样了：

你看，流程并不复杂：差异基因 → GO/KEGG 富集 → 生物学解释。 但具体怎么操作、用什么参数、怎么可视化、怎么解读，每一步都有坑。这门课就是要把这些坑一个一个填平。

1.5 一个真实的例子：肺腺癌差异基因富集

我曾在肺腺癌项目里对比了「肿瘤 vs 癌旁」的转录组数据。差异基因一共 1200 多个，做了 GO 和 KEGG 富集后，结果如下：

富集类别	富集条目（Top 3）	p-value
GO-BP	细胞分裂、DNA 修复、有丝分裂纺锤体检查点	1.5e-08, 3.2e-06, 2.1e-05
GO-CC	核仁、染色质、动粒	4.5e-07, 1.1e-05, 2.0e-05
GO-MF	ATP 酶活性、微管结合、DNA 解旋酶活性	1.9e-06, 2.7e-05, 3.1e-04
KEGG	细胞周期、p53 信号通路、DNA 复制	2.5e-10, 4.7e-06, 1.2e-05

从这个表你马上能看出什么？富集的通路都指向「细胞增殖失控」这个核心特征。 如果你只告诉我『差异基因列表里有 CDK1、CCNB1、CDC20』，可能觉得它们就是几个调控因子。 但通过富集分析，你发现了几个完整的、已被验证的通路，这远比单基因列表有力得多。

1.6 常见错误与建议

我踩过的坑，不想让你也踩一遍：

• 只看 P 值，不看富集倍数：有些通路虽然 P 值小，但只涉及到 1-2 个差异基因，这种「微富集」意义有限。我一般会同时看 GeneRatio（富集基因占比）。
• 忽略背景基因集：做富集时，一定要用所有检测到的基因作为背景，而不是只用差异基因。否则算出来的富集会严重夸大。
• 不作多重检验校正：P 值一定要经过调整（FDR 或 BH），默认的原始 P 值会高估显著性。