4. 数据质量评估（FastQC）

测序数据下来第一件事是什么？不是急着跑比对，也不是算变异。

先看看质量。我见过不少新手，直接拿原始FASTQ怼进流程，跑了一半报错，回头才发现是接头污染严重。白白浪费半天时间。

所以质量评估这步，我建议每个人都养成习惯：拿到FASTQ，先跑一遍FastQC。你想想看，就几分钟的事，能帮你躲开后面一堆坑。

4.1 为什么非做不可？

FastQC 干的事很简单——给你一份“测序报告”。

它会告诉你：

• 每条read的质量分布
• 碱基组成是否均匀
• 有没有接头残留
• GC含量是否异常
• 有没有过量的重复序列
• N的比例高不高

说白了，它就像体检单上的血常规。单项异常可能没事，但如果好几个指标同时飘红，就得警惕了。

4.2 快速上手：跑一次FastQC

安装很简单。如果用的 conda，一条命令搞定：

conda install -c bioconda fastqc

运行更简单。一个 FASTQ 文件就这样：

fastqc sample_R1.fastq.gz

一次跑多个文件：

fastqc sample_R1.fastq.gz sample_R2.fastq.gz

或者用通配符处理整个目录：

fastqc *.fastq.gz -o ./fastqc_results/

输出是两个文件：一个 .html 报告和一个 .zip 压缩包。我一般只看 .html，双击就能在浏览器打开。

fastqc -t 8 *.fastq.gz

4.3 报告逐项解读：别被“红叉”吓住

FastQC 报告分十来个模块，每个用绿勾、黄叹号、红叉标识“通过”、“警告”、“失败”。

我第一次看到满屏红叉时，心里咯噔一下。后来发现，有些红叉其实是“正常现象”。比如 RNA-seq 数据在“Per base sequence content”上几乎必挂——因为随机引物带来的偏差。嗯，这里要注意区分“真问题”和“假警报”。

4.3.1 最重要的几个模块

4.3.2 那些“挂掉也没事”的指标

• Per base N content：如果N比例整体很低（<5%），即使某段位置跳红，也往往是随机噪音。不用怕。
• Sequence Duplication Levels：RNA-seq 中高表达基因会产生大量重复reads，这是生物学信号，不是技术问题。但WGS中出现>50%的重复率，就要怀疑PCR duplication。
• Overrepresented sequences：偶尔几个高丰度序列可能是rRNA残留或常见接头。如果全是未知序列且比例很高，再查。

怎么判断是真的有问题？我的经验是：看趋势，不看单个点。比如质量箱线图，如果尾部掉到Q20以下，而且整条reads都偏低，那就得切。如果只是最后的几个碱基拉低，有时可以容忍——取决于后续分析对末端质量的敏感度。

4.4 应对策略：挂了的模块怎么办？

下面是我常用的“红框处理清单”：

1. Per base quality 挂 → 用 Trimmomatic / fastp 做滑动窗口切除，通常设置质量阈值Q20，窗口大小4bp。
2. Adapter Content 挂 → 先用 FastQC 识别接头类型（它会列出最可能的接头），再用 cutadapt 或 fastp 自动识别并切除。
3. GC content 异常 → 先排除污染。如果GC曲线出现两个峰，很可能是混入了其他物种的DNA。跑一下Kraken2 或 BLAST。
4. Sequence Duplication 过高 → WGS数据可以用Picard MarkDuplicates标记重复。RNA-seq 建议保留（除非做CNV分析）。

举个实际命令的例子。我用 fastp 做一步切除质量 + 去接头：

fastp -i raw_R1.fastq.gz -I raw_R2.fastq.gz \
      -o clean_R1.fastq.gz -O clean_R2.fastq.gz \
      --qualified_quality_phred 20 \
      --unqualified_percent_limit 40 \
      --cut_front --cut_front_window_size 1 --cut_front_mean_quality 20 \
      --detect_adapter_for_pe

4.5 一张图看懂FastQC核心流程

下面这张图概括了从拿到FASTQ到决定处理策略的完整逻辑。

4.6 批量处理与自动化

当样本量上来之后，一个个打开HTML报告看肯定不行。我通常会写一个简单的汇总脚本。

FastQC 的输出是 .zip 文件，里面包含 .txt 格式的统计数据。我们可以用 awk 或 Python 提取关键指标。

举个例子，提取所有样本的“基础质量”通过状态：

for zip in fastqc_results/*.zip; do
    unzip -q -o "$zip" -d /tmp/fastqc_tmp
    sample=$(basename "$zip" .zip)
    pass=$(grep "Per base sequence quality" /tmp/fastqc_tmp/*/fastqc_data.txt | awk '{print $NF}')
    echo "$sample $pass"
    rm -rf /tmp/fastqc_tmp/*
done

输出大概这样：

sample01 PASS
sample02 WARN
sample03 FAIL
sample04 PASS

看到 FAIL 的样本就优先处理。不用每个报告都看一遍。

4.7 避坑清单：我踩过的几个坑

• 只看平均值不看分布：有的样本整体平均Q30看起来很漂亮，但50%的reads尾端质量掉到Q10。平均掩盖了问题。要盯着箱线图看。
• 忽略读长信息：如果测序仪出了问题，可能出现某些read长度异常。FastQC的“Per base sequence quality”如果突然中断，可能是读长不一致。我曾经遇到过一个样本，fastp报告长度正常，但FastQC显示一半的reads只有50bp——原因是双端测序的第二端提前终止。还好FastQC及时发现了。
• 接头切除后忘了重新评估：切完接头后的数据，再跑一次FastQC。有时候第一次接头识别不准，或者切过了头导致质量下降。我吃过一次亏：切接头时参数设得太激进，把碱基含量切偏了，后续突变检测出现大量假阳性。重跑一次FastQC才发现问题。