📚 课程目录第3章测序原理与数据产生

3. 测序原理与数据产生

各位好，我是老陈。做生信这些年，经手过不下两百个测序项目，从 MiSeq 到 NovaSeq 都摸过。每次带着新人跑流程，我总要从这章讲起——你连数据怎么来的都不清楚，后面拿什么做变异检测？

Illumina 测序的核心原理

说白了，Illumina 的看家本事就三样：桥式 PCR、可逆终止子、边合成边测序（SBS）。这三个词记住了，整个流程就通了一半。

桥式 PCR 扩增

文库片段两端接上了接头，上机后它们会随机锚定在 Flow Cell 表面。我最初觉得这就像“钓鱼”——接头是鱼钩，Flow Cell 上的互补引物是鱼饵。一旦锚定，就原地开始桥式 PCR，形成一个簇（cluster）。每个簇里是同一文库片段的几千个拷贝。为什么要这么多拷贝？因为信号要够强才能被相机拍到。

我踩过的坑： 桥式 PCR 轮数控制不好，簇密度过高会导致簇间信号重叠，碱基错误率飙升。之前有个项目多跑了两个循环，结果 Q30 直接从 92% 掉到 85%。

边合成边测序

簇准备好后，加入带有四种可逆终止子的 dNTP。每个循环只加一个碱基，然后拍照记录荧光，再洗掉终止基团，进入下一个循环。这个“合成-拍照-去阻断”的循环次数就是你的读长，比如 150 或 300 个循环。

为什么会用到可逆终止子？因为如果一次能加多个碱基，相机根本分辨不出谁是谁。可逆终止子就像每个碱基都带了“刹车”，合成酶只能加一个就停，等我们拍完照再放开刹车。

嗯，说到这里，我把整个流程画成了一张图，方便你理解数据从哪来到哪去。

碱基识别：从 BCL 到 FASTQ

相机拍完回来的是什么呢？一组荧光图像。每个簇在每个循环会有 4 张图（对应 A、C、G、T 的波长），然后软件根据荧光强度分布判断该簇这个位置到底是哪个碱基。这就是碱基识别（Base Calling），结果写入 .bcl 二进制文件。

我遇到过新人直接拿 .bcl 做分析，以为它是 FASTQ。记住了：bcl 是原始信号，要转成 FASTQ 才能用。转换工具就是 Illumina 官方的 bcl2fastq，现在叫 bcl-convert。命令很简单：

bcl2fastq --runfolder-dir /path/to/run \
          --output-dir /path/to/fastq \
          --sample-sheet SampleSheet.csv \
          --no-lane-splitting

这里 --no-lane-splitting 是我个人习惯，我喜欢每条 lane 合并成一个 FASTQ，后面用样本索引区分。不过有些流程需要按 tile 拆分，那就要去掉这个参数。

Phred 质量分数

碱基识别不光给碱基，还给一个“靠谱程度”——Phred 质量分数 Q。公式很简单：

Q = -10 × log₁₀(P)，P 是碱基识别错误的概率。

所以 Q30 对应错误率 0.1%，Q20 对应 1%。如果你的数据 Q30 低于 80%，我会建议你重新测——我以前有个 WGS 项目 Q30 只有 72%，结果 SNP 假阳性率高了整整一倍。

注意： 不同 Illumina 仪器对 Q 的编码方式不同。老机器（GAIIx）用 ASCII 64 偏移，HiSeq/MiSeq 用 64 偏移（直到某个版本），Newer 机器（NovaSeq 6000 以上）默认用 33 偏移。你用 fastq-dump 或者 seqtk 查看头几行，看看 + 行后面的字符范围就能判断。搞错了会影响后续质控。

产量与质量控制

一台 Illumina 跑一板能产出多少数据？取决于三个因素：簇密度、读长、Flow Cell 的有效 lane 数和 tile 数。

参数	含义	典型值
簇密度 (K/mm²)	每 mm² 能承载的簇数	800 - 1200 (NovaSeq 1.5)
通过过滤 (PF) 比例	满足质量要求的簇占比	> 80%
读长	每端碱基数	150 bp (PE) 或 300 bp (PE)
有效 lane 数	Flow Cell 上的 lane 数	4 (HiSeq), 8 (NovaSeq S4)
总产量	全部有效碱基数	NovaSeq S4 PE150 ~ 3000 Gb

举个例子：NovaSeq 6000 用 S4 Flow Cell，簇密度 1000 K/mm²，PF 85%，读长 PE150，有效输出大约 3000 Gb。但实际上很少有跑满的，我见过最好的也就是 95% 的 PF。如果你的 PF 低于 70%，就需要排查：是不是文库有接头二聚体？或者桥式 PCR 过度了？

  经验之谈： 看产量不要只看原始总碱基数，要看“Q30 以上的有效碱基”。我手上有个批次，原始产量高达 320 Gb，但 Q30 只有 68%，真正能用的不到 200 Gb。建议在每个项目开始时就用 fastqc 检查，把低质量循环直接切除掉。

如何预估你的项目够不够用？

我自己的速算公式：目标覆盖度 × 基因组大小 = 需要的数据量。比如人类 WGS 要做 30×，基因组 3.2 Gb，那就是 96 Gb。加上数据利用率（通常 80% 左右能比对上的），实际所需总产量 = 96 / 0.8 = 120 Gb。如果你跑的是 NovaSeq S2 PE150，理论产量 500 Gb，那只要跑 1/4 的 lane 就够。但千万别跑太少——我踩过坑，为了省钱只跑了一个 tile，结果 SNPs 位点覆盖率严重不均匀。