4. 菌种纯化与保藏

发酵生产的起点不是发酵罐，而是一支可信的菌种。斜面或摇瓶中的培养物往往是混合群体，也可能携带自发突变株，若直接接入种子培养基，后续批次的重现性无从谈起。纯化解决"拿到单一遗传背景的克隆"，保藏解决"让这个克隆在数月到数年内保持性状不变"，菌种库管理则解决"每次生产都能追溯到同一支原始种子"。三者构成一条从分离到供种的完整链条，本节按这条链条展开关键操作与判断依据。

平板划线：把混合群体稀释成可辨认的单菌落

划线的本质是梯度稀释。以常见的三区划线为例：用接种环蘸取菌液后在第一区（约占平板1/3面积）往复划线5～7条，灼烧接种环并冷却，从第一区边缘引出第二区，再灼烧、冷却后从第二区引出第三区。每次换区前灼烧的目的不是灭菌本身，而是把环上残留的菌量降到更低数量级，使第三区能出现彼此分离的孤立菌落。若第一区菌液过浓，可在划线前用无菌生理盐水做10⁻¹～10⁻³梯度稀释，取0.1 mL涂布作为对照，便于估算浓度。

培养基与培养条件需与目标菌匹配：细菌常用营养琼脂，30～37 ℃培养18～48 h；酵母常用YPD或麦芽汁琼脂，25～30 ℃培养2～3 d；霉菌用PDA，25～28 ℃培养3～7 d。划线后应倒置培养，防止冷凝水滴落造成菌落连片。判读标准是：目标区出现直径1～3 mm、边缘整齐、表面光滑、色泽一致的单菌落，且菌落间有明显间距。若第三区仍连成片，说明接种量过大或换区时未灼烧，应重新划线而非勉强挑取。

单菌落挑取：从形态到显微的两次确认

挑取前先做形态筛查：同一平板上若出现两种以上菌落形态（大小、色泽、边缘、隆起度、表面干湿），说明纯化未完成，应挑取与目标形态一致的单菌落重新划线。挑取时用灼烧冷却的接种环或无菌枪头轻触菌落中心，避免带起周围琼脂；接入5 mL液体培养基，于适宜温度振荡培养至对数中期。

形态一致不等于纯培养，还需显微确认。取培养液涂片、革兰氏染色或简单染色，油镜下观察菌体形态、排列方式与革兰氏反应是否均一。以枯草芽孢杆菌为例，应为革兰氏阳性直杆状、单在或短链、有芽孢；若视野中出现革兰氏阴性短杆菌混杂，则挑取失败。对酵母可观察细胞形状、出芽方式与假菌丝有无。确认纯培养后，将菌液与30%～50%无菌甘油按1:1混合，或直接划线于斜面作为工作种子，进入保藏环节。

甘油管保藏与冻干保藏：两条互补的保存路线

甘油管保藏操作简便、复活快，适合实验室日常使用。配制60%甘油母液，121 ℃灭菌20 min；取对数中期菌液与甘油母液等体积混合，使终甘油浓度落在15%～25%（常用20%），分装1～1.5 mL至冻存管，−80 ℃保存。关键点是降温速率：直接投入−80 ℃冰箱即可满足多数细菌和酵母的需求，但对温度敏感的菌株宜先用程序降温盒以约−1 ℃/min降至−80 ℃，减少冰晶损伤。复活时快速置于37 ℃水浴至刚融化，立即转接液体培养基，避免甘油长时间滞留。

冻干保藏保存期长、运输方便，适合作为长期库的备份。流程为：收集对数后期菌体，用含脱脂乳或海藻糖的保护剂重悬（脱脂乳常用10%～12%浓度），分装至安瓿瓶或冻干瓶，每瓶0.2～0.5 mL，预冻至−40 ℃以下，再进入冻干机一次干燥（搁板−35～−40 ℃、真空度约0.1 mbar）与二次干燥（搁板升至20～25 ℃，去除结合水）。冻干后残水应控制在1%～3%，安瓿在真空或充氮条件下熔封，2～8 ℃避光保存。复活时用0.5～1 mL适宜液体培养基缓慢复水，静置10～20 min后再转接，切勿剧烈振荡。

菌种库管理：让每一批生产都能回到同一支原始种

规范做法是建立三级库。原始库（Master Cell Bank）由纯化确认后的菌液分装而成，数量不少于20～30支，只用于派生种子库，原则上不直接投入生产；种子库（Working Seed Bank）由原始库复苏扩培后分装，用于派生工作库；工作库（Working Cell Bank）直接供生产接种，用完即从种子库重新派生。三级之间逐级传代，工作库自身传代次数一般控制在5代以内，避免长期传代累积突变导致产量或抗性漂移。

每支管必须有唯一编号，台账至少记录：菌株名称与来源、分离日期、鉴定方法（形态、生化、16S rRNA或ITS序列）、代次、保藏方式与日期、存放位置（冰箱编号—层—盒—孔）、数量、操作人。冻存盒按位置编号并附位置图，取用后立即更新余量。原始库与种子库建议双人双锁、异地备份一份，防止冰箱故障造成不可逆损失。

管理不是一次性建库，而是持续验证。建议每6～12个月从各库随机抽取1～2支复活，检查复活时间、液体培养浊度到达时间、平板菌落形态与显微特征是否与建库记录一致；对生产菌株还应检测关键产物效价或酶活，偏差超过设定范围（例如效价下降超过15%）即判为不合格并追溯同批管。所有验证结果回填台账，形成"建库—发放—验证—淘汰"的闭环。