3. 原始数据质量评估与常见问题

测序仪下机得到的 FASTQ 文件，是后续所有分析的地基。地基里混进什么，下游就会放大什么。原始数据质量评估的目标，不是给数据打一个"好/坏"的分数，而是把 FASTQ 中隐藏的几类典型缺陷定位到具体的读段位置、具体的样本、具体的批次，从而决定是"直接进入比对"、"先修剪再比对"，还是"整批重测"。本节围绕低质量碱基、接头污染、重复序列、批次效应四类问题，讲清它们的信号特征、FastQC 的解读方式，以及从报告到处置的完整判断链。

FASTQ 里到底有什么可评估的

一条 FASTQ 记录由四行组成：以 @ 开头的序列标识、碱基序列、以 + 开头的分隔行、以及对应的质量字符串。质量字符是 Phred 质量值 Q 加上 33 后的 ASCII 码，Q 与错误率 p 的关系为 Q = -10·log₁₀(p)。Q20 对应 1% 错误率，Q30 对应 0.1%，Q40 对应 0.01%。FastQC 的"Per base sequence quality"图，横轴是读段上的碱基位置（1…150），纵轴是质量分箱，绿色区间为 Q28–Q36 附近的高质量区，黄色为 Q20–Q28 的警告区，红色为 Q20 以下的失败区。判断时不要只看中位数，要看下四分位线：如果第 100 位之后下四分位掉进黄色甚至红色，说明读段尾端已经不可靠。

一个常见的 Illumina 双端 150 bp 示例（以下数值为教学示例，非实测）：前 20 位中位质量 Q36，第 120 位降到 Q30，第 145 位下四分位跌到 Q18。这种"尾端衰减"通常来自测序试剂的消耗和荧光信号的累积衰减，属于可预期的物理现象，处置方式是按质量修剪而非丢弃整条读段。

四类典型问题的信号与识别

低质量碱基：表现为质量曲线随位置下滑，或在特定位置出现尖峰式塌陷。后者往往不是化学问题，而是测序仪在该循环的聚焦或流动池局部异常，需要结合 tile 级信息判断。

接头污染：当插入片段长度小于读长时，读段 3' 端会读穿插入片段进入接头序列。FastQC 的 "Adapter Content" 模块会给出 Illumina Universal Adapter（AGATCGGAAGAGC）等序列随位置的累积比例。若第 130 位后接头比例超过 5%，说明该文库插入片段偏短，必须做接头修剪，否则这些碱基会被比对工具当作错配或软剪切处理，降低有效比对率。

重复序列：FastQC 的 "Sequence Duplication Levels" 给出不同重复次数序列的占比。需要区分两类：一类是 PCR 扩增引入的重复，属于文库构建缺陷，会虚高表达量差异的假阳性；另一类是基因组本身的高覆盖区域（如 rRNA、线粒体），属于生物学真实信号。判断依据是重复序列的序列组成——若重复序列高度集中在少数几条，更可能是 PCR 重复。

批次效应：这是唯一无法从单个 FastQC 报告看出的问题。它需要把多个样本的 FastQC 指标横向排列：如果第 2 批次的 6 个样本接头含量普遍高于第 1 批次，或某批次整体 GC 含量偏移 3% 以上，就提示建库或测序批次引入了系统性偏差。批次效应必须在实验设计阶段记录样本的建库日期、操作人员、测序 lane，否则事后无法归因。

用 FastQC 跑出报告并读懂它

FastQC 的基本用法是逐文件或批量运行：

fastqc -t 4 -o ./qc_raw/ sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz
# 批量
fastqc -t 8 -o ./qc_raw/ ./*.fastq.gz

输出为每个样本一个 HTML 报告和一个 zip 压缩包。报告顶部是 Summary 表，列出 12 个模块的通过状态。解读时遵循三条原则：第一，先看失败项，再看警告项，通过项可以快速略过；第二，警告不等于必须处理，例如 RNA-seq 中 "Per sequence GC content" 出现警告，若样本本身 GC 分布就宽，属于正常；第三，多模块交叉验证，接头污染会同时推高 Adapter Content 和 Overrepresented sequences，两者一致才可确认。

对于双端数据，还要注意 R1 和 R2 的质量曲线往往不对称。R2 通常整体质量略低，因为它的测序在 R1 之后进行，试剂消耗更多。如果 R2 的 Q30 比例比 R1 低 5 个百分点以内，属于正常范围；若低 15 个百分点以上，需要检查是否 R2 的测序引物结合效率存在问题。

从报告到处置的判断链

评估的终点是处置决策，而不是报告本身。可以按以下顺序推进：

1. 质量修剪：用 Trimmomatic 或 fastp 按滑动窗口修剪。例如 SLIDINGWINDOW:4:20 表示 4 bp 窗口平均质量低于 Q20 就切断；LEADING:3 TRAILING:3 修剪首尾质量低于 Q3 的碱基。修剪后读长会缩短，需确认最短读长仍满足比对要求（一般 ≥36 bp）。
2. 接头去除：fastp 默认开启接头检测，也可用 --adapter_sequence AGATCGGAAGAGC 显式指定。修剪后重跑 FastQC，确认 Adapter Content 降到 1% 以下。
3. 重复处理：对 PCR 重复，可在比对后用 Picard MarkDuplicates 标记；对 UMI 文库，应在比对前按 UMI 去重。注意：去重会降低有效深度，需在实验设计时预留余量。
4. 批次效应：若确认存在批次偏差，可在表达矩阵层面用 ComBat 或 limma removeBatchEffect 校正，但校正不能替代实验设计。若某批次质量整体不可接受，重测比事后校正更可靠。

一份可复用的评估记录表

为了让评估结果可追溯、可比较，建议每个项目维护一份原始数据质量记录表。字段不必多，但必须覆盖"样本—批次—指标—处置"四要素：

表中 S3 的 Q30 仅 76%、重复率 35%，提示该样本建库复杂度偏低，若其差异表达结果出现异常，应优先怀疑重复带来的假阳性。S2 的接头含量 6.2% 超过 5% 阈值，必须修剪。把这张表和 FastQC 报告一起归档，后续任何分析异常都可以回溯到原始数据层面，而不是在结果阶段反复猜测。

原始数据质量评估的核心，是把"数据看起来还行"变成"我知道哪一位碱基、哪一条读段、哪一个批次有问题，并且已经做了对应处置"。做到这一点，下游的比对、定量和差异分析才有可靠的前提。