2. 实验设计中的批次规划
批次效应控制最有效的时机不是数据分析阶段，而是实验设计阶段。一旦样本在采集、处理、建库或上机时与生物学分组发生了系统性关联，后续任何算法都只能"缓解"而无法"消除"混杂。本节讨论如何在设计层面把批次从混杂因素转化为可估计、可校正的因子，核心手段是随机化、区组化、平衡设计与嵌套设计，以及围绕它们的一组工程策略。
一、先明确：批次为什么会变成混杂
设处理因素为 A（如对照组 vs 处理组），批次因素为 B（如第 1 批 vs 第 2 批）。若 A 与 B 完全重合——所有对照组都在第 1 批、所有处理组都在第 2 批——则 A 的效应与 B 的效应在数学上不可分辨，这就是完全混杂。此时模型 y ~ A + B 的设计矩阵出现共线性，批次校正会连同真实生物学差异一起扣除。
判断是否混杂，可以看设计矩阵的秩：若 A 与 B 的列向量线性相关，则秩亏，参数不可估。设计阶段的目标就是让 A 与 B 尽可能正交，或在无法正交时保证 B 可估、A 可估。
二、随机化：把批次"打散"到各组
随机化是防止混杂的第一道防线。它的作用不是消除批次，而是让批次在各处理组之间近似均匀分布，使批次效应与处理效应在期望上独立。
实际操作中，随机化要落实到三个层面：样本处理顺序随机化（避免同组样本连续处理）、板位/孔位随机化（避免同组样本集中在同一行或同一列）、上机顺序随机化（避免同组样本连续进样）。以 96 孔板为例，若把 24 个对照组全部放在 A–D 行、24 个处理组放在 E–H 行，则行位置效应与处理效应混杂；正确做法是用随机数把 48 个样本打散到 48 个孔位。
随机化有一个前提：样本量要足够。当每组样本很少（如 n=3）时，随机化仍可能产生不平衡，例如 3 个对照恰好全部分到第 1 批。因此随机化之后必须检查实际分配结果，必要时用限制性随机化（如按批次分层后在各层内随机）来保证平衡。
三、区组化：把已知的批次"装进"区组
区组化的思路与随机化相反：既然批次无法避免，就主动把它作为一个区组因子纳入设计，让每个区组内包含所有处理组。这样批次效应可以在区组间被估计并扣除，而处理效应在区组内比较，不受批次干扰。
典型做法是随机完全区组设计（RCBD）：若有 2 个批次、2 个处理组、每组 3 个重复，则每个批次内都安排 3 个对照和 3 个处理，共 12 个样本。此时批次与处理正交，模型 y ~ 处理 + 批次 可同时估计两者。
区组化的关键约束是：每个区组必须包含所有处理水平。如果某个批次只做了部分处理，区组就不完整，处理与批次重新出现部分混杂。因此区组化要求提前规划批次容量，确保每批都能容纳全部处理组。
四、平衡设计：让每个"格子"都有样本
平衡设计指各处理组在各批次中的样本数相等。平衡的好处是：批次效应与处理效应正交，方差分析中主效应可独立估计，统计功效最高。若不平衡，例如第 1 批对照 4 个、处理 2 个，第 2 批对照 2 个、处理 4 个，则处理效应与批次效应部分混杂，估计精度下降。
在工程上，平衡设计意味着样本量要按"处理×批次"的格子来分配。若计划 2 个处理组、3 个批次、每组总样本 12 个，则每个格子应为 2 个样本，而不是简单地每组 12 个随意分配。当样本量无法整除时，应优先保证关键比较（如对照 vs 处理）的平衡，允许次要比较轻微不平衡。
五、嵌套设计：当批次无法交叉时
有些场景下批次无法交叉。例如多中心研究，每个中心使用不同的仪器和试剂，中心内可以做全部处理，但中心之间无法交换样本；又如时间跨度很长的实验，早期批次与晚期批次使用的试剂批号不同，无法让每个批次都包含全部处理。此时应采用嵌套设计：处理嵌套于批次之内，或批次嵌套于处理之内。
嵌套设计的代价是：批次效应与处理效应不能完全分离，只能估计"批次内"的处理效应，再通过模型假设外推到总体。因此嵌套设计必须明确写出模型结构，例如 y ~ 处理 + 批次 %in% 处理，并在报告中说明批次是随机效应还是固定效应。
六、工程策略：把设计原则落到操作层
设计原则确定后，还需要一组可执行的工程策略来保证落地。以下八条是实践中反复验证有效的做法。
- 统一试剂批号：同一批实验尽量使用同一批号试剂、同一批培养基、同一批抗体。若必须更换批号，应在批次元数据中记录，并尽量让新旧批号在各处理组中均衡出现。
- 集中建库上机：把样本集中在尽可能短的时间窗口内完成建库和测序，减少时间跨度带来的仪器漂移和试剂衰减。
- 板内随机布孔：用随机数生成器分配孔位，避免同组样本占据同一行、同一列或同一角落。边缘孔效应明显的实验应避免把关键样本放在最外圈。
- 预留技术重复：在每批中放入相同的质控样本（如参考 RNA、混合样本），用于估计批次方差大小，并为后续校正提供锚点。
- 记录批次元数据：至少记录实验日期、仪器编号、操作者、试剂批号、建库批次、测序 lane 号。这些字段是后续建模时批次因子的来源。
- 设计矩阵检查：在实验开始前，用设计矩阵检查处理与批次是否共线。若秩亏，应调整分配方案，而不是等到分析阶段才发现。
- 预实验验证：正式实验前用小规模预实验评估批次波动幅度，判断批次效应是否大于处理效应，从而决定是否需要增加批次或调整设计。
- 方案冻结：实验中途不随意更改流程、试剂或仪器设置。若必须更改，应将其视为新批次并记录。
七、一个可参考的批次规划检查表
下表可作为实验开始前的核对工具，字段可根据具体实验类型增删。
| 检查项 | 判断标准 | 不通过时的处理 |
|---|---|---|
| 处理与批次是否完全混杂 | 设计矩阵满秩，A 与 B 不共线 | 重新分配样本，确保每批含全部处理组 |
| 各格子样本数是否平衡 | 处理×批次各格样本数相等或接近 | 调整样本分配，优先保证关键比较平衡 |
| 随机化是否覆盖三个层面 | 处理顺序、孔位、上机顺序均随机 | 用随机数重新生成分配表 |
| 批次元数据是否完整 | 日期、仪器、操作者、试剂批号齐全 | 补充记录表，缺失字段标注为未知 |
| 是否预留质控样本 | 每批至少 1 个技术重复或参考样本 | 在每批中插入混合样本或参考品 |
| 批次容量是否足够 | 每批可容纳全部处理组 | 拆分批次或改用嵌套设计并说明 |
批次规划的本质是在实验开始前回答三个问题：批次能否避免？若不能避免，能否让每批包含全部处理？若不能包含全部处理，能否保证批次可估？这三个问题的答案分别对应随机化、区组化/平衡设计和嵌套设计。把这三个问题在设计阶段解决，后续分析阶段的批次校正才有意义。