2. 肝脏生理与病理基础
肝脏器官芯片不是把肝细胞放进一个透明小室那么简单。芯片要复现的，是肝脏在“结构—细胞—微环境—病理”四个层面上的关键特征。理解这些特征，才能判断芯片设计是否合理、培养条件是否到位、模型是否具备预测价值。本节从肝小叶结构出发，逐步展开到肝细胞功能、非实质细胞作用，以及纤维化和脂肪肝的病理模拟需求。
一、肝小叶：肝脏功能的最小结构单元
肝小叶是肝脏的基本结构单位，呈近似六棱柱形，直径约1～2 mm，高约2 mm。每个肝小叶以中央静脉为轴心，周围分布着多个门管区。门管区内含肝动脉分支、门静脉分支和胆管，三者合称“门管三联”。血液从门管区流向中央静脉，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列成肝细胞索（肝板），相邻肝细胞之间形成胆小管，胆汁由此向门管区方向流动。
这种结构决定了肝脏最核心的功能逻辑：血流与胆汁流方向相反。门静脉血从外周流向中央，胆汁从中央流向门管区。肝细胞沿这条路径呈现明显的代谢分区：靠近门管区的肝细胞（1区）氧分压高、糖异生和脂肪酸氧化活跃；靠近中央静脉的肝细胞（3区）氧分压低、糖酵解和药物代谢（尤其CYP450酶系）更活跃；2区介于两者之间。这一分区现象称为“肝小叶代谢分区”，是肝脏芯片设计时必须考虑的空间梯度。
芯片模拟需求：若芯片仅将肝细胞均匀铺在培养腔中，会丢失代谢分区特征。更合理的做法是构建氧梯度或营养梯度，例如通过微流控通道控制入口氧浓度，使培养腔从入口到出口形成氧分压递减，从而诱导分区化基因表达。常用指标包括入口氧分压设定在约 60～80 mmHg，出口降至约 20～30 mmHg，培养 3～7 天后检测 CYP1A2、CYP3A4、PCK1、G6PC 等分区标志物的空间分布。
二、肝细胞功能与芯片功能验证
肝细胞是肝脏的实质细胞，占肝脏体积约 80%、细胞总数约 60%。其核心功能包括：白蛋白合成、尿素合成、糖原储存与糖异生、脂质代谢、胆汁分泌、以及一相（CYP450）和二相（葡萄糖醛酸转移酶、谷胱甘肽转移酶）药物代谢。在芯片中，这些功能不能只看细胞是否存活，而要用功能指标验证。
以白蛋白分泌为例，原代肝细胞在芯片中培养 7 天，上清白蛋白浓度通常应维持在 10～50 μg/mL/10⁶ 细胞/天的量级（示例参考值，因供体与培养条件而异）。尿素合成可通过检测培养液中尿素浓度评估，正常培养条件下约 20～100 μg/10⁶ 细胞/天。药物代谢功能可用睾酮 6β-羟化反应评估 CYP3A4 活性，或使用底物探针如非那西丁评估 CYP1A2。若这些指标在 3 天内快速下降，说明培养微环境不支持肝细胞表型维持，需要检查培养基配方、氧供、剪切力或细胞外基质包被条件。
三、非实质细胞：芯片中的“协同角色”
肝脏中非实质细胞约占细胞总数 40%，包括肝窦内皮细胞（LSEC）、库普弗细胞（KC，即肝巨噬细胞）、肝星状细胞（HSC）和胆管上皮细胞。它们不是配角，而是维持肝细胞功能、参与免疫应答和病理进程的关键。
LSEC 形成肝窦壁，具有窗孔结构，允许血浆成分与肝细胞接触，同时维持肝细胞极性。芯片中若缺少 LSEC，肝细胞会逐渐失去极性，胆小管结构难以形成。KC 是肝脏固有免疫细胞，在炎症刺激下释放 TNF-α、IL-6 等细胞因子。HSC 静息状态下储存维生素 A 和脂滴，在损伤刺激下转化为肌成纤维细胞，分泌大量胶原，是肝纤维化的核心效应细胞。
芯片共培养时，常用比例参考：肝细胞 : LSEC : KC : HSC 约为 10 : 3 : 1 : 1（示例比例，可根据研究目的调整）。共培养可显著延长肝细胞功能维持时间，并允许模拟炎症和纤维化过程。
四、肝纤维化与脂肪肝的芯片模拟需求
肝纤维化是慢性损伤后细胞外基质过度沉积的结果，核心机制是 HSC 活化。在芯片中模拟纤维化，通常采用“损伤刺激—HSC 活化—胶原沉积”的路径。常用刺激包括 TGF-β1（浓度约 1～10 ng/mL，持续 3～7 天）、乙醇代谢产物或游离脂肪酸。活化标志物包括 α-SMA、COL1A1、TIM P1 表达上调，以及培养腔中胶原含量增加。芯片的优势在于可形成梯度：损伤刺激从入口进入，HSC 活化沿通道呈梯度分布，更接近体内纤维化从门管区向中央静脉扩展的过程。
脂肪肝（非酒精性脂肪性肝病，NAFLD）的特征是肝细胞内脂滴过度积累。芯片模拟通常采用游离脂肪酸混合物（如油酸 : 棕榈酸 = 2 : 1，总浓度约 0.5～1 mM）处理肝细胞 24～72 小时。脂滴可用 BODIPY 或油红 O 染色定量，甘油三酯含量可用酶法检测。若同时加入炎症因子（如 TNF-α 或 LPS），可进一步模拟非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的炎症特征。芯片中还可引入 LSEC 和 KC，观察脂质积累后免疫细胞的募集和细胞因子释放，形成更完整的病理链条。
五、从结构到病理：芯片设计检查要点
综合以上内容，设计或评估一块肝脏芯片时，可对照以下要点：是否保留了肝小叶代谢分区的空间梯度？肝细胞功能指标（白蛋白、尿素、CYP450）是否在培养期内维持？是否包含至少一种非实质细胞以支持肝细胞极性和免疫应答？病理模拟时是否有明确的刺激物、浓度、时间和检测标志物？这些要点决定了芯片模型是“有肝细胞”还是“能模拟肝脏”。
| 模拟对象 | 关键细胞/结构 | 示例刺激或条件 | 观察指标 |
|---|---|---|---|
| 肝小叶代谢分区 | 肝细胞、氧梯度 | 入口 O₂ 60～80 mmHg，出口 20～30 mmHg | CYP1A2、CYP3A4、PCK1 空间分布 |
| 肝细胞功能维持 | 肝细胞、ECM 包被 | 培养 3～7 天 | 白蛋白、尿素、CYP3A4 活性 |
| 肝纤维化 | HSC、肝细胞 | TGF-β1 1～10 ng/mL，3～7 天 | α-SMA、COL1A1、胶原含量 |
| 脂肪肝 | 肝细胞、KC、LSEC | 油酸:棕榈酸=2:1，0.5～1 mM，24～72 h | 脂滴染色、甘油三酯、TNF-α |
表中参数为教学示例参考值，实际实验中需根据细胞来源、芯片构型和检测方法进行优化。理解肝脏生理与病理基础，是后续芯片设计、培养方案制定和结果判读的前提。