2. 连续生物过程的关键单元操作
连续生物过程并不是把传统批次工艺简单“拉长”，而是由若干具有连续输入输出特征的单元操作串联而成。理解这些单元操作各自的时间尺度、物料状态和接口条件，是后续预测控制与优化能够落地的前提。本节围绕灌流培养、连续层析、连续病毒灭活、连续浓缩换液、在线配液以及它们之间的物料流衔接展开，重点说明每个单元“连续在哪里、控制什么、与上下游如何对接”。
灌流培养：细胞留在反应器，产物持续排出
灌流培养的核心是细胞截留与培养基连续置换。细胞被中空纤维膜、交替切向流（ATF）或声波截留装置保留在生物反应器内，含产物的上清液以灌流速率 Qp 连续排出，同时新鲜培养基以相近速率补入。关键参数是比灌流速率 VVD（反应器体积/天）和细胞比生长速率 μ。典型 CHO 灌流工艺中，VVD 常设在 0.5～2.0 反应器体积/天，活细胞密度可稳定在 40～100×106 cells/mL。
灌流培养的控制难点在于：细胞密度、代谢物（葡萄糖、乳酸、氨）与产物浓度之间存在耦合。若只按固定 VVD 运行，细胞密度上升后葡萄糖会逐渐耗尽；若按葡萄糖反馈调节 VVD，则产物浓度和下游负荷会随之波动。因此实际运行中常采用“葡萄糖浓度为主、乳酸与氨为约束”的串级控制，把 VVD 作为操纵变量，同时用细胞排放（bleed）把密度限制在目标区间。
连续层析：从周期性循环到连续上样
连续层析用多根小柱替代单根大柱，通过周期性切换实现连续上样与连续洗脱。常见形式包括模拟移动床（SMB）和周期性逆流层析（PCC）。以三柱 PCC 为例，同一时刻一根柱在上样、一根在洗脱、一根在再生/平衡，切换周期 tc 由载量决定。若单柱载量为 40 g/L，上样浓度为 2 g/L，上样流速 1 柱体积/min，则单周期上样时间约为 20 min，三柱交替即可实现近似连续的产品流出。
连续层析的控制变量是切换时间、上样流速和洗脱梯度。切换过早会降低载量利用率，切换过晚则目标产物穿透流失。工程上通常用紫外信号（280 nm）监测穿透点，把穿透达到设定阈值（如 5% 最大吸收）作为切换触发条件，而不是单纯依赖固定时间。这样可以在原料浓度波动时保持收率稳定。
连续病毒灭活：低 pH 保持时间决定灭活效果
连续病毒灭活通常采用低 pH 孵育。物料被调至 pH 3.6～3.8 后，在保持管路或孵育罐中停留规定时间（如 30～60 min），再回调 pH。连续化的关键是“停留时间分布”要窄：若采用活塞流反应器（PFR）式管路，停留时间由管长与流速决定；若采用多级连续搅拌罐（CSTR）串联，则停留时间分布变宽，部分物料可能未达到有效灭活时间。
控制上，pH 是第一变量，温度是第二变量，停留时间是第三变量。三者共同决定病毒对数减少值（LRV）。实际运行中需在线监测 pH 与流量，用流量反推停留时间，并设置低流量联锁，防止物料在管路中停留不足。
连续浓缩换液：切向流与在线配液协同
连续浓缩换液多采用切向流过滤（TFF）。物料在膜表面循环，小分子与缓冲液透过膜排出，大分子产物被截留浓缩。连续模式下，进料与透析液同时补入，透过液连续排出，使产物浓度和缓冲液组成保持稳定。关键参数是跨膜压（TMP）、剪切速率和透析液流速。TMP 过高会导致膜污染加剧，过低则通量不足。
换液效率可用透析体积比（DV）衡量：DV = 透析液体积 / 物料体积。若目标是把缓冲液 A 置换为缓冲液 B，残留 A 的比例约为 e-DV。例如 DV=5 时，残留约 0.67%；DV=7 时，残留约 0.09%。连续换液时，透析液流速与产物排出流速需匹配，否则产物浓度会漂移。
在线配液与物料流衔接
在线配液（inline dilution）用高浓度母液与稀释液按比例混合，实时生成所需缓冲液。相比预配大罐，在线配液节省体积、便于连续供给，但对混合精度和流量控制要求更高。常用做法是母液泵与稀释液泵按比例联动，用电导率或 pH 反馈修正比例。
物料流衔接是连续工艺最容易被忽视的环节。上游灌流收获液是连续低浓度流，下游层析需要周期性上样，两者之间存在“连续—间歇”的节奏差。解决办法是设置中间储罐或连续上样缓冲罐，用液位控制上游排出速率，用上样泵控制层析进料速率。若中间罐液位持续上升，说明下游处理能力不足；若液位持续下降，说明上游供给不足。液位是判断整条线是否平衡的最直接信号。
物料流衔接的工程判断
把上述单元操作串起来看，整条连续线的稳定性取决于两个匹配：一是流量匹配，上游排出速率与下游进料速率要一致；二是时间尺度匹配，灌流以天计、层析以分钟计、配液以秒计，必须用中间储罐和缓冲罐吸收节奏差。实际运行中，操作人员最常观察的三个信号是：中间罐液位、层析 UV280 穿透曲线、灭活段 pH 与流量。液位持续偏离设定值，说明整条线尚未达到稳态；穿透提前出现，说明上样量或流速需要调整；pH 或流量越限，则触发联锁保护。