3. 菌种分离、纯化与鉴定

菌种保藏的第一步不是“把菌放进冰箱”，而是先获得一株身份清楚、纯度可靠的纯培养物。环境样品中通常混杂着细菌、放线菌、真菌孢子、酵母以及大量非目标微生物，若分离策略选择不当，后续纯化与鉴定会反复返工。本节围绕“从环境样品到可保藏纯培养”的完整链条展开，重点说明分离策略、纯化方法、形态与分子鉴定流程，以及保藏前必须完成的身份确认。

一、分离策略：先定目标，再定培养基与预处理

分离策略的核心是“让目标菌长出来，让非目标菌少长出来”。常见环境样品包括土壤、水体、根际、发酵食品、空气沉降物等。以土壤中放线菌分离为例，可取 1 g 土样加入 9 mL 无菌生理盐水，振荡 10 min 制成 10⁻¹ 悬液，再梯度稀释至 10⁻³～10⁻⁵。稀释涂布时，每个平板取 0.1 mL，用无菌涂布棒涂匀。若目标是放线菌，可在培养基中加入重铬酸钾（示例：50 mg/L）抑制细菌和真菌；若目标是真菌，可加入链霉素（示例：50 mg/L）抑制细菌。预处理同样关键：土壤悬液在 55 ℃水浴处理 10 min，可减少热敏感细菌，提高芽孢菌或放线菌的分离概率；而真菌孢子则更适合用低 pH 培养基（示例：pH 4.5～5.5）抑制细菌。

分离策略不是单一方法，而是“样品预处理 + 培养基选择 + 稀释梯度 + 培养条件”的组合。下表给出三类常见目标菌的示例参数，便于对照选择。

培养结束后，挑取形态差异明显的单菌落。挑取时用无菌接种环蘸取少量菌体，先在平板边缘划线纯化，再转接斜面或液体培养基。若平板上菌落密集，可先用“分区划线法”获得单菌落：将平板分为 3～4 个区域，每区划线后灼烧接种环，最后一区可得到彼此分离的单菌落。

二、纯化方法：从混合菌落到单菌落

纯化的目标是获得遗传背景一致的纯培养物。常用方法有分区划线法、稀释涂布法、单菌落挑取法和液体稀释法。分区划线法适合细菌和酵母，操作快，但依赖操作者手法；稀释涂布法适合放线菌和真菌孢子，能定量，但易污染；单菌落挑取法适合菌落形态差异明显的样品；液体稀释法适合在液体中生长的微生物，但需多次转接确认纯度。

判断是否纯化成功，不能只看“长得一样”。应在同一平板上观察菌落大小、形状、边缘、隆起度、颜色、质地、透明度是否一致；同时做革兰氏染色或简单染色，镜检细胞形态是否均一。若出现两种以上菌落形态或镜检发现杂菌，应重新划线纯化。通常需要连续 2～3 次转接，每次均确认单菌落形态一致，才可视为纯培养。

三、形态与分子鉴定流程

纯化后进入鉴定环节。形态鉴定包括菌落形态、细胞形态、革兰氏染色、芽孢染色、鞭毛染色等；分子鉴定则以 16S rRNA 基因（细菌）或 ITS 区（真菌）测序为主。典型流程为：挑取单菌落 → 液体培养过夜 → 离心收集菌体 → 提取基因组 DNA → PCR 扩增目标片段 → 琼脂糖凝胶电泳检测 → 测序 → 序列比对（如 NCBI BLAST 或 EzBioCloud）→ 确定种属。以细菌 16S rRNA 为例，常用引物为 27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′），扩增片段约 1.5 kb。PCR 程序示例：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30 个循环；72 ℃ 10 min。测序结果与数据库比对时，若相似度 ≥ 99%，可初步判定为同种；若在 97%～99% 之间，可能为同属不同种；低于 97% 则可能为新种或新属，需结合生理生化特征进一步确认。

四、保藏前必须完成的身份确认

身份确认是保藏前的最后一道关口。一株菌若身份不明，保藏后可能被误用、误传，甚至造成生物安全风险。身份确认至少应包含以下内容：菌株编号（如 LAB-2024-001）、种属名称（如 Bacillus subtilis）、来源信息（样品类型、采集地点、日期）、纯度确认（菌落形态一致、镜检无杂菌）、鉴定方法（形态 + 16S rRNA 或 ITS 测序）、保存日期与保存人。若测序相似度处于 97%～99% 之间，应在记录中注明“暂定为某属，待进一步鉴定”，不能直接写成确定种名。