3. 抗体序列获取与注释

抗体人源化的第一步不是改序列，而是把序列“读准”。同一段重链可变区（VH），在IMGT、Kabat、Chothia三套编号体系下，CDR的起止位置可能相差数个残基；若编号错位，后续的CDR移植、回复突变设计和人源化程度评估都会建立在错误坐标上。本节围绕“拿到序列→确定编号→比对种系→识别CDR→形成注释表”这条主线，讲清各系统的差异与实战操作。

一、三套编号系统的定位差异

编号系统的本质，是给可变区残基一套“位置坐标”，使不同抗体之间可以逐位对齐。三者出发点不同：

• Kabat：最早基于抗体序列同源性建立，以CDR的序列变异度为划分依据，历史上应用最广，许多老数据库和文献仍以Kabat标注CDR。
• Chothia：在Kabat框架基础上，依据抗体晶体结构中CDR环的几何构象重新界定CDR边界，尤其对H1、H2环的起止做了修正，更适合结构建模。
• IMGT：由IMGT数据库提出，基于胚系基因（V、D、J）的边界定义，把可变区划分为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，编号连续、无插入字母，且与种系基因比对天然兼容，是目前人源化与抗体工程的主流标准。

关键差异集中在CDR1和CDR2的边界。以VH为例，Kabat的CDR-H1通常从31位开始，而IMGT的CDR1从27位开始，把Kabat中属于FR1的26–30位纳入CDR1；CDR-H2在IMGT中为56–65位，比Kabat的50–65位更短。CDR-H3三者基本一致，均覆盖95–102附近区域，但IMGT以C104和WGxG基序为锚点，边界更明确。

二、种系基因比对：找到最接近的人源框架

人源化的核心思路是把鼠源框架替换为最接近的人源胚系框架，同时保留关键CDR和Vernier区残基。因此，种系比对不是可选项，而是设计起点。

比对流程通常为：将VH、VL序列分别提交IMGT/V-QUEST或IgBLAST，选择人源（Homo sapiens）胚系基因库，得到V、D、J基因的匹配结果及同一性百分比。重点关注三项：

1. V基因同一性：一般要求≥70%，越高说明框架越接近人源，需要回复突变的位点越少。
2. CDR3长度与序列：CDR3是特异性核心，通常完整保留，不参与人源化替换。
3. 关键框架残基：位于Vernier区（如VH的71、73、78、93位）的残基常影响CDR构象，若人源框架与鼠源不一致，需评估是否回复突变。

例如，某鼠源VH与IGHV1-69*01同一性为72%，CDR-H3为12个氨基酸。比对结果显示FR3的71位为丙氨酸（A），而IGHV1-69该位为缬氨酸（V）。该位属于Vernier区，若直接替换可能改变CDR-H2构象，因此设计时保留鼠源A或做A/V回复突变评估。

三、CDR自动识别工具与注释实战

常用工具包括IMGT/V-QUEST、IgBLAST、ANARCI、AbYsis和Antibody Numbering等。它们各有侧重：IMGT/V-QUEST适合IMGT编号与种系比对一体化；ANARCI支持多体系编号且可批量处理；IgBLAST适合大规模序列筛查。

以下是一段VH序列经ANARCI编号后的注释示例（示例数据，非实测）：

序列: EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIW...
编号体系: IMGT
CDR1: 27-38   GFSLTSYG
CDR2: 56-65   IWGGGNT
CDR3: 105-117 ARDYYGSSYWYFDV
FR1: 1-26, FR2: 39-55, FR3: 66-104, FR4: 118-128
种系比对: IGHV1-69*01 (同一性 72%), IGHJ4*01 (同一性 85%)

拿到注释后，应逐项核对：CDR1是否包含IMGT定义的27–38位、CDR2是否为56–65位、CDR3是否以C104和WGxG为锚点。若发现CDR3被截断或FR4缺失，通常是序列末端不完整或测序质量低，需要回退到原始测序峰图确认。

四、注释结果的核对与常见问题

自动工具的输出不能直接照单全收，需人工核对三类问题：

• CDR边界偏移：不同工具对CDR1起点的判定可能相差1–2位，应以IMGT锚点（如CDR1的27位、CDR3的C104）为准，必要时手动修正。
• 种系基因选择偏差：同一性最高的V基因不一定是最佳框架，还需考虑该基因在人群中的频率、免疫原性及CDR长度兼容性。
• 序列末端不完整：若FR4或CDR3末端缺失，编号会整体错位，需回到原始测序数据确认，不可强行注释。

五、注释表交付示例

一个可执行的注释表应至少包含以下字段，便于后续人源化设计直接调用：

完成注释后，下一步才是基于该坐标进行CDR移植与框架替换。编号和注释的准确性，直接决定人源化设计的可靠性——这一步做扎实，后续的回复突变和亲和力验证才有意义。