4. SDS-PAGE 纯度分析实战
SDS-PAGE 是蛋白纯度分析中最常用的方法之一，它的价值不仅在于“跑出一张胶”，更在于通过凝胶配方、上样量、染色脱色和条带判读，获得可重复、可比较、可解释的纯度信息。本节围绕一次完整的纯度分析实验展开，重点讲清楚每个环节的关键参数和判断依据。
一、凝胶配制：分离胶与浓缩胶的分工
SDS-PAGE 通常采用不连续缓冲体系，由上层浓缩胶和下层分离胶组成。浓缩胶一般为 4%～5% 丙烯酰胺，pH 6.8，作用是把样品压缩成极窄的起始带；分离胶根据目标蛋白分子量选择浓度，pH 8.8，负责按分子量大小分离。常用经验是：目标蛋白分子量越大，分离胶浓度越低；分子量越小，浓度越高。例如目标蛋白约 50 kDa，可选 10%～12% 分离胶；若目标蛋白约 15 kDa，则宜选 15% 分离胶。
配制时先灌分离胶，液面加异丙醇或水封顶以隔绝氧气并压平界面；待分离胶聚合后倒去封顶液，再灌浓缩胶并插入梳子。聚合时间受温度影响明显，室温偏低时可适当延长，但不要通过过量增加 TEMED 或过硫酸铵来强行加速，否则容易导致凝胶变脆、条带扭曲。一个常见教学示例配方如下：10% 分离胶（10 mL 体系）含 30% 丙烯酰胺 3.3 mL、1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8 2.5 mL、10% SDS 0.1 mL、10% 过硫酸铵 0.1 mL、TEMED 4 μL，补水至 10 mL。该配方属于示例，实际应按试剂批次和目标蛋白调整。
二、上样量优化：让目标条带落在可定量区间
上样量直接决定条带是否可定量。上样过少，杂质条带低于检测限，纯度会被高估；上样过多，目标条带饱和、拖尾，杂质条带也可能重叠，纯度会被低估。优化的核心是让目标条带在染色后处于“清晰但不饱和”的区间。对于考马斯亮蓝染色，常见上样范围为每孔 5～30 μg 总蛋白；对于银染，灵敏度更高，通常每孔 0.1～2 μg 即可。
实际操作中可先做上样量梯度，例如设置 5、10、20、30 μg 四个孔，同一块胶上比较。若 20 μg 时目标条带已明显加深且边缘变钝，说明接近饱和；若 5 μg 时杂质条带几乎不可见，则说明该上样量不适合杂质判读。纯度分析建议选择目标条带清晰、杂质条带可辨识、且目标条带未饱和的上样量，并在报告中注明。上样前样品需与还原型上样缓冲液混合，通常 95～100 ℃ 加热 5～10 min，使蛋白充分变性并解聚。
三、电泳、染色与脱色：从分离到可视化的关键控制
电泳先在 80～100 V 下让样品通过浓缩胶，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后，可提高到 120～150 V。电压过高会导致条带变宽、发热严重，甚至凝胶变形。电泳结束的判断通常是指示剂前沿到达凝胶底部约 0.5～1 cm 处，或目标蛋白已充分分离。
染色常用考马斯亮蓝 R-250 或 G-250。R-250 染色液通常含甲醇、乙酸和水，染色 30～60 min；脱色液为甲醇/乙酸/水混合液，需多次更换直至背景干净。脱色不足会造成背景深、杂质条带被掩盖；脱色过度则低丰度杂质条带会消失。银染灵敏度高，但步骤多、重复性要求高，适合检测低丰度杂质。无论哪种染色，都应保留同一批次染色的空白胶和分子量标准，便于后续判读。
四、条带定量与纯度估算
条带定量通常借助凝胶成像系统或 ImageJ 等软件完成。基本步骤是：拍摄或扫描凝胶，确保目标条带未过曝；用矩形选框圈出每条条带，扣除邻近背景；得到各条带的积分灰度值。纯度可按“目标条带灰度 / 所有条带灰度之和 × 100%”估算。若目标条带灰度明显高于其他条带，且无可见杂质条带，可报告为“电泳级纯度≥95%”之类的结论，但必须注明检测方法和上样量。
需要注意的是，考马斯亮蓝染色对低丰度杂质不敏感，银染虽灵敏但线性范围较窄。因此，纯度数值应结合染色方法解释。例如同一批样品，考染显示单一条带，银染却出现两条杂质带，说明样品中确实存在低丰度杂质，只是考染检测限不足。此时应报告银染结果，并说明检测限差异。
五、杂质条带判读：位置、强度与对照
杂质条带判读不能只看“有没有条带”，而要结合位置、强度和对照。常见杂质类型包括：宿主细胞蛋白残留、降解片段、聚集体、载体蛋白或标签切除不完全的产物。判读时先看分子量标准，确认目标条带位置是否与理论分子量一致；再看空白胶和阴性对照，排除试剂或操作引入的假条带；最后比较不同上样量下杂质条带的变化，若杂质条带随上样量线性增强，说明它来自样品本身，而非染色伪影。
若目标条带下方出现弥散拖尾，可能是上样量过大或样品未充分变性；若目标条带上方出现高分子量条带，可能是聚集体或未还原完全；若多条泳道同一位置出现条带，则更可能是试剂污染或凝胶问题，而非样品杂质。判读结论应尽量具体，例如“在约 25 kDa 处可见一条杂质条带，银染下明显，考染下不可见，推测为低丰度降解片段”，而不是笼统写“有杂质”。
综上，SDS-PAGE 纯度分析的关键在于：凝胶浓度匹配目标分子量，上样量落在可定量区间，染色脱色控制背景，条带定量有对照，杂质判读结合位置、强度和空白对照。把这些环节做扎实，才能让一张胶真正成为纯度判断的依据，而不是仅仅“看起来干净”。