📚 课程目录第4章短串联重复序列STR分型原理

4. 短串联重复序列STR分型原理

STR（Short Tandem Repeat，短串联重复序列）分型是细胞系鉴定中最常用的金标准方法。它的核心思想并不复杂：在人类基因组中，存在大量由2～7个碱基为重复单元、首尾串联数十次的DNA片段，这些片段在不同个体、不同细胞系之间，重复次数存在天然差异。只要选取足够多这样的位点，扩增后测量每个位点片段长度，就能得到一组“长度指纹”，用于判断两份细胞样本是否同源、是否被交叉污染或错误标记。

理解STR分型，需要把整条技术链拆成四个环节：位点选择、扩增、毛细管电泳、等位基因判读与数据格式。下面按这条链路展开。

一、STR位点选择：为什么是这些位点

并非任意重复序列都适合做细胞系鉴定。位点选择通常遵循几条原则：高多态性（人群中重复次数差异大，区分能力强）、染色体分布分散（避免连锁，减少同一染色体上多位点同时变化带来的误判）、扩增稳定（引物结合区保守，不易出现等位基因丢失）、片段长度适中（一般控制在80～350 bp，便于多重PCR和电泳分辨）。

目前细胞系鉴定普遍采用国际公认的STR位点组合，例如ANSI/ATCC ASN-0002推荐的8个核心位点（D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、vWA、TH01、TPOX、CSF1PO）加上性别位点Amelogenin，共9个位点；扩展方案还会加入D21S11、D18S51、D3S1358、FGA、D8S1179等，形成16～24个位点的多重体系。位点越多，随机匹配概率越低，鉴定结论越可靠。

需要特别说明的是，细胞系鉴定与法医个体识别虽然都用STR，但位点组合和判读阈值并不完全相同。细胞系鉴定更关注“是否同源、是否污染”，因此常采用ATCC或ICLAC推荐的参考数据库（如ATCC STR Database、DSMZ、Cellosaurus）进行比对，而不是直接套用法医个体识别标准。

二、扩增：多重PCR如何同时读出多个位点

选定位点后，下一步是用多重PCR（multiplex PCR）在同一反应管中同时扩增所有目标位点。每个位点设计一对特异性引物，其中一条引物5′端带有荧光标记（如FAM、HEX、TAMRA、ROX等），使扩增产物带上可检测的荧光信号。为了在毛细管电泳中区分不同位点，通常把片段长度范围接近的位点用不同荧光颜色标记，形成“颜色+长度”的双重区分。

一个典型的多重PCR反应体系（示例，仅作教学参考）可包含：模板DNA 1～10 ng、2×PCR Master Mix 10 μL、引物混合物2～4 μL、去离子水补足至20 μL。扩增程序一般为：95℃预变性5 min；然后94℃ 30 s、60℃ 60 s、72℃ 60 s，循环28～32次；最后72℃延伸10 min。循环数不宜过高，否则容易产生非特异扩增和“stutter”峰（滑移峰），干扰后续判读。

扩增完成后，产物需要与内标（internal size standard，如LIZ-500或GS-500）混合，内标是一组已知长度的荧光标记片段，用于在电泳中建立“迁移时间—片段长度”的换算关系。这一步是后续等位基因判读的基准。

三、毛细管电泳：把长度差异变成可读信号

毛细管电泳（CE）是STR分型的核心分离手段。其原理是：在细内径石英毛细管中填充聚合物筛分介质，施加高压电场，带负电的DNA片段向正极迁移。片段越短，穿过聚合物网络越快；片段越长，受阻越大，迁移越慢。于是，不同长度的扩增产物在时间上被分开，依次经过检测窗口，荧光标记被激光激发并记录为电泳图谱（electropherogram）。

电泳图谱的横轴是迁移时间或换算后的片段长度（bp），纵轴是荧光强度（RFU）。每个位点通常表现为一个或两个主峰：杂合子有两个峰，纯合子有一个峰。峰的位置对应等位基因长度，峰的高度/面积反映扩增产量。内标峰均匀分布在图谱中，用于校准。

四、等位基因判读：从峰到编号

电泳图谱生成后，软件（如GeneMapper、OSIRIS、STRait Razor等）会根据内标峰的位置，把每个样品峰换算成片段长度（bp），再对照等位基因分型标准物（allelic ladder）换算成等位基因编号。等位基因编号不是随意命名，而是以国际标准分型梯中该位点最常见等位基因的重复次数为基准，例如TH01的“9.3”表示9个完整重复加3个碱基的不完整重复。

判读时需要注意几个关键点：

杂合子峰高平衡：两个等位基因峰高比一般应在0.5～2.0之间。若明显偏离，可能提示等位基因丢失、引物结合区突变或模板质量差。
stutter峰识别：PCR滑移会在主峰前约4 bp处产生小峰，通常低于主峰15%。若stutter峰过高，可能提示模板量过低或循环数过多。
峰高阈值：一般要求主峰RFU大于200（不同平台阈值略有差异），低于阈值视为无效峰，不能用于判读。
三峰或异常峰：若某位点出现三个峰，可能提示样本中存在混合细胞或污染，需要进一步排查。

判读完成后，每个细胞系得到一组等位基因组合，例如：D5S818 11,12；D13S317 11,11；D7S820 10,11；TH01 7,9.3；Amelogenin X,Y。这组数据就是该细胞系的STR指纹。

五、数据格式与比对

STR数据最终以表格形式保存，常见格式为两列或三列：位点名称、等位基因1、等位基因2。例如：

Locus        Allele1   Allele2
D5S818       11        12
D13S317      11        11
D7S820       10        11
D16S539      9         13
vWA          16        17
TH01         7         9.3
TPOX         8         8
CSF1PO       10        12
Amelogenin   X         Y

拿到这组数据后，需要与参考数据库（如ATCC、DSMZ、Cellosaurus）中该细胞系的标准STR图谱进行比对。比对通常采用两种指标：匹配百分比（相同等位基因数/总等位基因数）和相似度评分（如Tanabe算法、Masters算法）。一般认为，匹配度≥80%可判定为同源或相关；低于80%则提示可能不是同一细胞系，或存在交叉污染、遗传漂变。

实操提示：细胞系STR鉴定建议使用新鲜提取的DNA，模板量控制在1～10 ng。若使用冻存细胞，应避免反复冻融。每批实验应设置阳性对照（如已知STR图谱的细胞系）和阴性对照（无模板水），以监控污染和试剂有效性。

常见误区：STR分型结果“匹配”并不等于细胞系绝对正确。若两株细胞系本身遗传背景相近（如来自同一供体），或数据库参考图谱不完整，仍可能出现误判。因此，STR结果应结合细胞形态、生长特性、标志物表达等信息综合判断。

总结来说，STR分型是一条从“选位点”到“读数据”的完整技术链：位点选择决定分辨能力，多重PCR决定信号来源，毛细管电泳决定分离效果，等位基因判读和数据格式决定结果能否被正确比对和共享。掌握这条链路，才能在细胞系鉴定中做出可靠判断。