2. 动物细胞培养基础
CRISPR 编辑的第一步并不是设计 sgRNA，而是让细胞活着、长稳、长到合适的密度。动物细胞没有细胞壁，对剪切力、渗透压、pH 和温度都远比细菌敏感，因此培养基础直接决定后续转染效率、单克隆筛选成功率和基因型验证的可信度。本节围绕四个相互衔接的环节展开：选什么细胞、怎样保持无菌、培养基怎么配、以及如何传代与冻存复苏。
一、常用细胞系选择：先看“编辑目的”，再看“培养难度”
CRISPR 实验常用的动物细胞大致分为三类。第一类是贴壁永生化细胞系，如 HEK293T、HeLa、A549、NIH/3T3。它们增殖快、转染效率高、成本低，适合做敲除效率的快速验证和 sgRNA 筛选。其中 HEK293T 因表达 SV40 大 T 抗原，配合 PEI 或脂质体转染可获得较高效率，是多数实验室的首选“试刀”细胞。第二类是悬浮或半悬浮细胞，如 Jurkat、K562，常用于免疫相关基因编辑，但转染方式需改为电转。第三类是原代细胞与干细胞，如小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）、诱导多能干细胞（iPSC），更接近生理状态，但传代次数有限、对培养基和基质要求高，编辑难度显著上升。
选择时可参考三个判断点：一是核型与倍性，HEK293T 接近三倍体，敲除一个等位基因后仍可能保留功能，做纯合敲除需确认所有等位基因；二是转染适配性，贴壁细胞可用脂质体，悬浮细胞优先电转；三是筛选标记，若使用嘌呤霉素或新霉素抗性，需先做杀伤曲线确定工作浓度。教学示例中，若以 HEK293T 做 EMX1 位点敲除，通常按 6 孔板每孔 2×105 个细胞接种，次日融合度约 70% 时转染，这一密度兼顾了转染效率与后续扩增空间。
二、无菌操作技术：把污染挡在操作之外
动物细胞培养的污染源主要有细菌、真菌、支原体和交叉细胞污染。无菌操作的核心不是“消毒很彻底”，而是建立气流屏障、减少暴露时间、区分洁净等级。超净工作台使用前应开紫外照射 20～30 分钟，随后开风机预运行 10 分钟，使台面形成稳定层流。操作时双手从台面内侧向外移动，避免手臂跨越已打开的瓶口；瓶盖打开后应保持倾斜，瓶口靠近火焰或处于层流下游。
试剂分装是降低污染的关键习惯：血清、双抗、胰酶应小份分装，避免反复冻融和整瓶污染。每次操作前后用 75% 乙醇擦拭台面和手套，但注意乙醇未干时不要靠近酒精灯。若培养基在 24～48 小时内由清亮变浑浊、pH 迅速变黄并伴异味，多为细菌污染；若出现丝状或点状漂浮物，考虑真菌；若细胞形态正常但生长变慢、需提高血清浓度才能维持，应怀疑支原体，可用 PCR 或荧光染色确认。发现污染后应立即丢弃并高压灭菌，不要试图用抗生素“救回”，否则容易污染培养箱和共享试剂。
三、培养基配制：配方、pH 与渗透压的平衡
以常用的 DMEM 高糖培养基为例，其基础成分包括氨基酸、维生素、无机盐和葡萄糖（约 4.5 g/L）。完整培养基通常由基础培养基、10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素-链霉素和 1% 谷氨酰胺组成。FBS 提供生长因子和附着因子，但批次差异明显，正式实验前应做批次测试。谷氨酰胺在溶液中易降解为氨，建议使用稳定型二肽（如 GlutaMAX）或现配现用。
配制时先加入约 80% 体积的灭菌超纯水，依次加入干粉培养基并轻柔搅拌，避免产生大量泡沫。随后按需加入碳酸氢钠调节缓冲能力，用 1 mol/L HCl 或 NaOH 将 pH 调至 7.2～7.4（37 ℃、5% CO2 条件下平衡后约为 7.4）。渗透压应控制在 280～320 mOsm/kg，偏离会导致细胞皱缩或膨胀。配好后用 0.22 μm 滤膜过滤除菌，4 ℃ 避光保存，并在瓶身标注配制日期、批号和有效期。含血清的完全培养基一般 2 周内用完，无血清基础液可保存 1 个月。
四、传代、冻存与复苏：维持细胞状态的操作闭环
贴壁细胞传代通常在融合度达到 80%～90% 时进行，过度汇合会引起接触抑制、形态改变和编辑效率下降。以 T25 瓶为例：弃去旧培养基，用不含 Ca2+/Mg2+ 的 PBS 洗 1～2 次，加入 0.25% 胰酶-EDTA 约 1 mL，37 ℃ 消化 1～3 分钟，镜下见细胞回缩变圆、轻拍瓶壁即脱落时，立即加入 2～3 mL 完全培养基终止消化。轻柔吹打 10～15 次形成单细胞悬液，按 1:3～1:6 比例分瓶，补足培养基后放入 37 ℃、5% CO2 培养箱。
冻存时，将细胞离心（约 200×g，5 分钟）后重悬于含 10% DMSO 的冻存液中，分装至冻存管，放入程序降温盒置于 −80 ℃ 过夜，次日转入液氮长期保存。DMSO 可降低冰晶损伤，但室温下对细胞有毒性，操作应尽量快。复苏时从液氮取出后 37 ℃ 水浴快速融化（约 1～2 分钟），立即加入 5～10 倍体积的完全培养基稀释 DMSO，离心弃上清后重悬接种。复苏后 24 小时换液一次，去除未贴壁死细胞，通常 2～3 天可恢复对数生长。
把上述四个环节串起来看，细胞系决定实验上限，无菌操作决定实验能否继续，培养基决定细胞状态，传代与冻存复苏决定实验能否重复。对 CRISPR 编辑而言，转染当天细胞应处于对数生长期、融合度约 70%、无污染且形态均一，这是后续获得稳定编辑效率的前提。建议每次传代记录细胞代次、融合度、培养基批号和观察到的异常，形成可追溯的培养日志，一旦编辑效率波动，可以快速定位是细胞状态问题还是编辑体系问题。