4. sgRNA设计与脱靶预测
CRISPR-Cas9 的切割位置并不由 Cas9 自己决定，而是由 sgRNA 的 20 nt 间隔序列（spacer）通过碱基互补配对引导到目标 DNA 上。因此，一次基因编辑实验的成败，很大程度上在设计阶段就已经被 sgRNA 的质量决定了。本节围绕“如何设计一组候选 sgRNA 并给出排序”展开，重点讲清序列规则、PAM 限制、GC 含量、二级结构与脱靶评分这五个相互制约的维度，并给出一个可复现的候选排序流程。
一、先明确靶位点的三个硬约束
设计 sgRNA 的第一步不是挑序列，而是确定“哪些位置可以被编辑”。对最常用的 SpCas9（野生型）而言，有三个硬约束：
- PAM 限制：SpCas9 识别 NGG（N 为任意碱基），PAM 位于靶序列的 3' 端下游。也就是说，基因组上只有紧邻 NGG 的 20 nt 序列才能作为候选 spacer。若使用 SpCas9 变体（如 SpCas9-NG 识别 NG，或 xCas9 识别 NG/NAA 等），PAM 范围会放宽，但脱靶风险通常随之上升。
- 位置约束：若目标是敲除基因功能，应优先选择靠近 5' 端的外显子，使移码突变尽早破坏蛋白结构域；若目标是精确点突变或同源重组修复，则应把切割位点放在目标碱基附近（通常 10～30 bp 内），并考虑同源臂方向。
- 序列唯一性：spacer 必须在参考基因组中尽量唯一，避免落在重复序列、同源基因家族或旁系同源区域，否则脱靶预测会非常困难。
二、序列规则与 GC 含量
在满足 PAM 的候选序列中，需要按以下规则筛选：
- GC 含量：推荐 40%～60%。GC 过低（<30%）会降低 sgRNA 与靶 DNA 的杂交稳定性，切割效率下降；GC 过高（>70%）容易形成二级结构，也可能增加脱靶。以 20 nt 为例，GC 数在 8～12 个之间较为理想。
- 避免连续 T：连续 4 个以上 T（TTTT）可能被 RNA 聚合酶 III 识别为终止信号，导致 sgRNA 转录提前终止。若使用化学合成 sgRNA，则主要影响不大，但仍建议避免。
- 避免极端碱基分布：如连续 4 个以上相同碱基、或 5' 端为 G 后接多个 C 等，都可能影响转录或折叠。
- 5' 端碱基偏好：多项研究表明，spacer 5' 端为 G 或 A 时，U6 启动子转录效率较高；若 5' 端不是 G，可在体外转录时额外添加 G，但这会改变 spacer 长度，需谨慎。
- 种子区域：PAM 近端的 8～12 nt（即 spacer 3' 端）是决定特异性的关键区域，该区域与靶序列的错配容忍度最低，设计时应优先保证其与靶标完全匹配。
三、二级结构评估
sgRNA 本身会折叠，若 spacer 区域形成稳定的发夹或与 scaffold 区域发生分子内配对，会阻碍其与靶 DNA 结合。评估时可用 RNAfold、Mfold 等工具计算最小自由能（ΔG）。经验上，spacer 区域自身折叠的 ΔG 若低于 -10 kcal/mol，需警惕；更关键的是检查 spacer 是否与 scaffold 的某些区段形成互补。若发现强二级结构，可尝试更换候选位点，或在不改变靶向特异性的前提下调整 spacer 边界。
四、脱靶预测工具与评分逻辑
脱靶预测的核心是：在基因组中搜索与 spacer 相似（允许少量错配）且邻近 PAM 的序列，再按位置和错配类型打分。常用工具包括：
- Cas-OFFinder：快速枚举全基因组中允许一定错配数和 PAM 变体的潜在脱靶位点，适合作为初筛。
- CRISPOR / CRISPRscan：整合多个评分模型，输出 MIT 特异性评分、CFD 评分等，并给出脱靶位点列表。
- Benchling / CHOPCHOP：在线设计平台，可直接给出候选 sgRNA 的脱靶预测和排序。
评分时重点关注：脱靶位点是否落在外显子、启动子或其它功能区域；错配是否集中在种子区域；脱靶位点的 CFD 评分是否接近 1（越接近 1 越危险）。通常建议优先选择 MIT 特异性评分 > 70、CFD 评分 < 0.2 的候选。
五、一组候选 sgRNA 的设计与排序示例
假设我们要敲除人类基因 GENE-X 的第 3 号外显子（该外显子编码关键结构域），参考序列已知。按以下步骤操作：
- 提取第 3 号外显子及其上下游各 100 bp 序列，用 Cas-OFFinder 或在线工具扫描所有 NGG 位点，得到约 30 个候选 spacer。
- 计算每个 spacer 的 GC 含量，剔除 <40% 或 >60% 的候选，剩余约 18 个。
- 剔除含 TTTT、连续 4 个以上相同碱基的候选，剩余约 14 个。
- 用 RNAfold 计算 spacer 区域二级结构，剔除 ΔG < -10 kcal/mol 的候选，剩余约 10 个。
- 将剩余候选输入 CRISPOR，获取 MIT 特异性评分和 CFD 评分，并查看脱靶位点是否落在功能区域。
- 按“MIT 特异性 > 70 且 CFD < 0.2”优先排序，选出前 3 条作为实验候选。
下表给出一组假设的候选排序结果（数据为示例，非实测）：
| 候选 | spacer（5'→3'） | PAM | GC% | ΔG (kcal/mol) | MIT 特异性 | CFD | 排序 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| A | GACCTG...（示例） | AGG | 55 | -6.2 | 82 | 0.08 | 1 |
| B | TCAGGT...（示例） | TGG | 45 | -12.5 | 68 | 0.15 | 2 |
| C | CCGCGG...（示例） | CGG | 70 | -4.1 | 75 | 0.30 | 3 |
| D | TTTTGG...（示例） | GGG | 50 | -8.0 | 60 | 0.45 | 淘汰 |
六、设计完成后的检查清单
- spacer 是否紧邻 NGG（或所选变体对应的 PAM）？
- GC 含量是否在 40%～60%？
- 是否含 TTTT 或连续 4 个以上相同碱基？
- spacer 区域二级结构 ΔG 是否高于 -10 kcal/mol？
- MIT 特异性评分是否 > 70？CFD 是否 < 0.2？
- 脱靶位点是否落在外显子、启动子或其它功能区域？
- 是否准备了 2～3 条独立 sgRNA 用于并行验证？
完成以上步骤后，你就得到了一组有排序、有依据的候选 sgRNA。下一步是合成或克隆这些 sgRNA，并进入细胞实验验证环节。