3. 性能确认的关键质量指标

性能确认不是“跑完一次测序看结果好不好”，而是用一组可量化、可复现、可判读的指标，把仪器、试剂、文库与生信流程的整体表现固定下来。本节围绕十个关键质量指标，说明它们的定义、计算方式与判读边界。理解这些指标之间的耦合关系，比单独记住某个阈值更重要。

一、碱基质量与 Q30

测序仪对每个碱基给出一个质量值 Q，定义为 Q = −10·log₁₀(P_error)，其中 P_error 是该碱基判读错误的概率。Q30 对应错误率 10⁻³，即千分之一；Q20 对应 1%，Q40 对应万分之一。Q30(%) 的计算方式是：质量值 ≥ 30 的碱基总数 ÷ 总碱基数 × 100%。

例如某次 PE150 运行产出 300 Gb 原始数据，其中 Q30 碱基为 276 Gb，则 Q30 = 276/300 = 92.0%。判读时要注意：Q30 是“比例”而非“绝对量”，低产出高 Q30 与高产出略低 Q30 的可用数据量可能相近。通常要求 Read 1 与 Read 2 分别统计，因为双端测序中 Read 2 的 Q30 往往略低。此外，Q30 应结合循环位置曲线看——若前 20 个循环 Q30 很高、后段骤降，说明存在测序后期信号衰减或试剂耗尽，而非文库问题。

二、簇密度与簇通过率

簇密度（Cluster Density，单位 K/mm²）指流动槽上单位面积内被识别并参与测序的簇数量。它由文库上样浓度、簇生成方式和仪器光学系统共同决定。计算上，簇密度 = 有效簇数 ÷ 流动槽成像面积。例如 NovaSeq 类平台 S1 流动槽常见目标区间约 200–400 K/mm²，而 MiSeq 类平台约 800–1200 K/mm²，具体以平台规格为准。

簇密度过低会浪费流动槽容量、降低总产出；过高则簇间重叠，导致信号串扰、Q30 下降和 PF（Passing Filter，通过过滤）比例降低。因此实际判读时通常同时看两个量：簇密度是否落在目标窗口内，以及 PF(%) 是否达标（一般 ≥ 80%）。若簇密度偏高且 PF 偏低，优先排查上样浓度是否过高；若簇密度正常但 PF 低，则更可能是簇生成或试剂问题。

三、比对率、重复率与覆盖度

比对率（Mapping Rate）指能比对到参考基因组的 reads 占全部 reads 的比例，反映文库与参考基因组的匹配程度。计算公式为：比对率 = 成功比对的 reads 数 ÷ 总 reads 数 × 100%。对于人全基因组重测序，合格文库通常要求 ≥ 95%（含唯一比对与多重比对）；若明显偏低，需考虑污染、接头残留、物种不匹配或参考基因组版本错误。

重复率（Duplication Rate）指因 PCR 扩增或簇生成随机性产生的重复 reads 占比，常用 Picard MarkDuplicates 等工具统计。重复率 = 重复 reads 数 ÷ 总 reads 数 × 100%。它受文库复杂度、起始投入量和 PCR 循环数影响。低起始量文库重复率可达 20%–40%，而高复杂度文库通常低于 10%。判读时应区分“文库重复”与“测序重复”，并结合唯一分子标签（UMI）判断是否可去重。

覆盖度（Coverage）通常指目标区域被 reads 覆盖的深度或比例。平均深度 = 总比对碱基数 ÷ 目标区域长度；覆盖广度 = 被覆盖碱基数 ÷ 目标区域长度 × 100%。例如 1% 覆盖广度指目标区域中 99% 的碱基至少被 1 条 read 覆盖。深度与广度需同时看：深度高但广度低，说明存在覆盖空洞。

四、均一性、错误率与检出限

均一性（Uniformity）衡量目标区域各位置覆盖深度的离散程度，常用指标包括：≥0.2×平均深度的碱基比例、变异系数 CV、或 Fold-80 penalty。Fold-80 表示“80% 的目标碱基达到的深度”与“平均深度”的比值，越接近 1 越均一。均一性差通常源于 GC 偏好、捕获探针效率差异或 PCR 偏倚。

错误率（Error Rate）是整体碱基判读错误的比例，可由 Q 值反推，也可通过比对到参考基因组后统计错配碱基数 ÷ 总比对碱基数得到。需注意区分测序错误与真实变异：前者随机分布、质量值低，后者常集中在特定位置且质量值高。

检出限（Limit of Detection，LoD）指在给定置信度下能稳定检出的最低变异等位基因频率（VAF）。例如某肿瘤 panel 声称 LoD 为 1% VAF，意味着在 500× 深度下，至少 5 条 reads 支持该变异时可稳定检出。LoD 与深度、错误率、重复率直接相关：深度越高、错误率越低，可检出的 VAF 越低。

五、精密度与准确度

精密度（Precision）反映重复测量之间的一致程度，常用标准差、CV 或重复间一致性表示。例如同一样本重复建库测序三次，某位点 VAF 分别为 12.1%、11.8%、12.3%，则精密度高；若为 12.1%、9.5%、14.0%，则精密度差。精密度不依赖真值，只描述离散程度。

准确度（Accuracy）反映测量值与真值的接近程度，常用偏差（Bias）或相对误差表示。例如已知标准品 VAF 为 10%，测得 10.4%，则偏差 +0.4%。准确度需要参考品或已知真值才能评估，而精密度只需重复样本。两者关系是：精密度高不一定准确（可能存在系统偏差），准确度高也不一定精密度高（可能单次碰巧接近真值）。

六、判读顺序与常见误区

实际性能确认中，建议按“先看簇密度与 PF，再看 Q30 与错误率，再看比对率与重复率，最后看覆盖度、均一性、LoD、精密度与准确度”的顺序逐层排查。原因在于：前一层指标异常会直接污染后一层，若跳过前层直接看 LoD，容易把系统性问题误判为生信问题。

常见误区有三个。第一，只看 Q30 不看簇密度：Q30 达标但簇密度偏低，总产出可能不足，实际可用数据量不达标。第二，把重复率等同于文库质量：重复率受起始量影响很大，低起始量样本重复率偏高属正常，需结合 UMI 与唯一深度判断。第三，把精密度当准确度：重复三次结果一致，只能说明系统稳定，不能说明结果接近真值，必须用标准品或已知样本验证准确度。