2. 等温扩增的分子生物学基础
等温核酸扩增并不是把 PCR 的“变温”简单换成“恒温”，而是把解链、引物退火、链延伸这三件事重新分工：由聚合酶、辅助蛋白或特殊引物结构在恒定温度下持续制造可被再次识别的单链入口。理解这一节，关键不是背概念，而是建立“模板结构—酶行为—引物几何—动力学输出”的因果链。只有这条链清楚，后面选 LAMP、RPA、RCA 或 SDA 时，才知道每种方法为什么需要不同的酶、缓冲体系和引物排布。
一、核酸结构：等温扩增真正利用的是“可被打开的单链窗口”
双链 DNA 在生理条件下以右手双螺旋存在，碱基对通过氢键配对，两条链靠疏水堆积和碱基堆积力维持稳定。常规 PCR 用 94～98 ℃ 把双链拆开，而等温体系必须在 37～65 ℃ 范围内找到局部单链区域。这个局部单链窗口通常来自三种途径：一是引物或辅助寡核苷酸先结合，形成短的双链区并置换出旁侧单链；二是模板本身存在 AT 富集区、发夹、G-四链体等易打开结构；三是聚合酶或解旋酶主动拆开双链。
因此，等温扩增的模板设计不能只看“有没有目标序列”，还要看目标区段的二级结构。若靶标区域 GC 含量过高、形成稳定发夹，即使引物能结合，聚合酶也可能在延伸时被卡住。实际设计中，常把引物结合位点选在自由能较低、单链倾向较强的区段，并用 mfold 或 RNAfold 类工具检查 ΔG。示例性判断标准是：引物 3′ 端所在局部结构的 ΔG 不宜低于 −3 kcal/mol；若低于该值，可尝试移动引物位置或加入甜菜碱、DMSO 等辅助剂降低二级结构稳定性。
二、聚合酶特性：链置换能力决定“能不能连续扩增”
等温扩增最核心的酶学指标是链置换活性。当聚合酶沿模板延伸时，若前方遇到另一条已配对的 DNA 链，普通 Taq 类聚合酶会被阻挡，而 Bst DNA 聚合酶大片段、Bsm、Phi29 等具有链置换结构域，能把下游链“推开”继续合成。Bst 2.0/3.0 的最适温度约 60～65 ℃，延伸速度约 50～100 nt/s，适合 LAMP；Phi29 的最适温度约 30～37 ℃，持续合成能力强、错误率低，适合 RCA 和滚环扩增。
除链置换外，还要关注三个参数：持续合成能力决定一次结合能走多远；3′→5′ 外切活性决定保真度，Bst 大片段通常缺失该活性，Phi29 则保留校对能力；热稳定性决定体系能否在 60 ℃ 以上长时间工作。若用 Bst 做 LAMP，通常配 0.32 U/μL 左右；若用 Phi29 做 RCA，常用 0.5～1 U/μL，并补充 BSA 提高稳定性。酶量过低会延迟出峰，过高则易产生非特异扩增，表现为阴性对照也出现上升曲线。
三、引物设计原则：几何关系比序列本身更关键
等温体系的引物不是一对，而是一组。以 LAMP 为例，需要 F3、B3、FIP、BIP、LF、LB 六条引物。FIP 由 F2 和 F1c 拼接而成，其中 F2 与靶标 F2c 结合，F1c 与上游 F1 区互补，形成环状结构；BIP 同理。F3/B3 负责起始置换，LF/LB 负责加速环化。设计时需同时满足：各引物 Tm 在 60～65 ℃ 之间且相互接近；3′ 端避免连续 4 个以上相同碱基；F2 与 F1c 间距约 40～60 nt；FIP/BIP 的 5′ 端不能形成稳定二聚体。
RPA 则用 30～35 nt 的长引物，配合 UvsX 重组酶和单链结合蛋白 gp32，在 37～42 ℃ 工作。其引物设计更强调“重组酶介导的链入侵”，因此引物长度比 LAMP 更长，且不需要复杂的环状结构。无论哪种体系，引物二聚体和发夹都是首要排除项，建议用 PrimerExplorer 或 NUPACK 做二级结构筛查，并保留至少 3 组候选引物用于实测筛选。
四、扩增动力学：从“起峰时间”反推起始模板量
等温扩增的动力学曲线通常呈 S 形：初期荧光或浊度缓慢上升，进入指数期后快速攀升，最后因引物或 dNTP 耗尽进入平台期。与 qPCR 类似，等温体系用“起峰时间”Tt（time-to-threshold）表征起始模板量。模板越多，达到阈值所需时间越短；模板越少，Tt 越长。示例性数据：以 106 copies/μL 为高浓度模板，Tt 约 8 min；103 copies/μL 时 Tt 约 16 min；阴性对照在 30 min 内不出现上升。若阴性对照也起峰，说明引物二聚体或气溶胶污染已构成假阳性，需要重新设计引物或加强分区操作。
动力学还受温度、Mg2+ 浓度和甜菜碱影响。Bst 体系常用 6～8 mM Mg2+，Mg2+ 过低会降低酶活，过高则增加非特异扩增；甜菜碱 0.8～1.2 M 可降低二级结构稳定性，但超过 1.5 M 会抑制酶活。实际优化时，建议先固定引物浓度和酶量，再对 Mg2+ 和甜菜碱做二维梯度，观察 Tt 和阴性对照是否同时满足“阳性早、阴性平”的要求。