3. 样本前处理与核酸提取
数字PCR（dPCR）的定量结果建立在“每个微反应单元中模板分子随机分配”这一统计前提之上，因此它对样本前处理的要求与qPCR并不完全相同。qPCR关注的是扩增曲线的Ct值，对少量抑制剂和片段化有一定容忍度；而dPCR最终要数的是阳性微滴/微孔的个数，任何导致模板丢失、分配不均、扩增效率下降或荧光基线漂移的因素，都会直接转化为浓度偏差。因此本节的核心不是“把核酸提出来”，而是“提出来一份适合被分割、被扩增、被计数的核酸”。
一、适用于数字PCR的样本类型
dPCR可处理的样本类型相当广泛，但不同样本的核酸丰度、完整性和抑制剂背景差异很大，前处理策略必须区别对待。常见类型包括：
- 液体活检类：血浆、血清、尿液、脑脊液。这类样本中游离DNA（cfDNA）浓度低（血浆中常为1～100 ng/mL），片段短（约160～170 bp为主峰），且高度片段化。提取时应优先选择能回收短片段的方法，避免使用会截留小片段的硅胶柱。
- 组织与细胞类：新鲜组织、FFPE切片、培养细胞、口腔拭子。FFPE样本核酸交联严重、片段化严重，需先脱蜡、蛋白酶K消化并延长裂解时间。
- 微生物与环境类：全血、痰液、粪便、水体滤膜。这类样本抑制剂复杂（血红素、腐殖酸、多糖、胆盐），且目标核酸常与大量背景核酸共存。
- 植物与食品类：叶片、种子、加工食品。多糖和多酚是主要抑制物，需增加CTAB或PVP处理。
选择样本类型时，应同时评估三个维度：目标核酸的绝对量是否落在dPCR动态范围内（通常每反应1～10⁵拷贝）、片段长度是否覆盖引物/探针设计区间、抑制剂是否会在微滴生成或扩增阶段造成干扰。
二、核酸提取方法的选择
dPCR常用的提取方法可归为三类，各有适用边界：
| 方法 | 原理 | 适用样本 | 对dPCR的影响 |
|---|---|---|---|
| 硅胶柱离心法 | 高盐条件下核酸吸附硅胶膜，低盐洗脱 | 细胞、组织、血液 | 回收率高，但短片段（<100 bp）易丢失 |
| 磁珠法 | 羧基磁珠在PEG/NaCl体系中结合核酸 | 血浆cfDNA、FFPE、自动化平台 | 可调结合条件以富集短片段，重复性好 |
| 沉淀法 | 异丙醇/乙醇沉淀核酸 | 大体积水样、低浓度样本 | 回收片段范围宽，但残留盐类需充分洗涤 |
对于血浆cfDNA，推荐使用磁珠法并优化结合液比例，使160 bp左右片段回收率最大化；对于FFPE，需在裂解液中加入更高浓度蛋白酶K（如0.5～1 mg/mL）并延长消化至过夜，以解除甲醛交联。提取过程中应避免反复冻融和剧烈涡旋，因为机械剪切会进一步加剧片段化。
三、抑制剂去除与片段化控制
dPCR的微滴生成和扩增对抑制剂比qPCR更敏感。常见抑制剂包括：血红素、腐殖酸、多糖、乙醇、异丙醇、SDS、EDTA、肝素等。去除策略应贯穿裂解、结合、洗涤和洗脱全过程：
- 裂解阶段：使用含离液盐的裂解液，并加入蛋白酶K消化蛋白；对富含多糖的植物样本，加入PVP或CTAB。
- 结合阶段：磁珠法可通过增加洗涤次数（如2～3次70%乙醇洗涤）去除盐类和蛋白残留。
- 洗脱阶段：使用低盐缓冲液（如10 mM Tris-HCl, pH 8.0）或无核酸酶水，避免EDTA浓度过高（>0.5 mM会螯合Mg²⁺，抑制Taq酶）。
- 额外净化：对抑制剂严重的样本，可增加一步柱纯化或使用抑制剂去除试剂盒；也可将模板稀释5～10倍后再进dPCR，但需注意稀释会降低低丰度目标的检出概率。
片段化控制方面，cfDNA本身已高度片段化，应避免进一步剪切；而基因组DNA样本若片段过长（>10 kb），在微滴生成时可能堵塞通道或分配不均，可通过超声打断或酶切将片段控制在1～5 kb。FFPE样本则需评估片段长度是否覆盖扩增子（通常要求扩增子<150 bp）。
四、提取质量评估
提取完成后，不能仅凭“有核酸”就进入dPCR。应至少评估以下指标：
- 浓度与纯度：用荧光染料法（如Qubit）测浓度，A260/A280在1.8～2.0，A260/A230>2.0。注意：Nanodrop对低浓度cfDNA不准确，应以荧光法为准。
- 片段完整性：用片段分析仪或琼脂糖凝胶电泳评估，cfDNA主峰应在160～170 bp；FFPE样本DV200（>200 bp片段占比）应>30%。
- 抑制剂残留：可用dPCR或qPCR检测内参基因，比较不同稀释度下的Ct或阳性微滴数是否一致；若稀释后信号明显改善，说明存在抑制剂。
- 功能验证：最直接的方法是用已知浓度的标准品或内参进行dPCR，观察阳性微滴比例是否符合泊松分布预期。
在实际操作中，建议将上述评估结果记录为一份提取质控表，至少包含：样本编号、样本类型、提取方法、洗脱体积、浓度、A260/A280、A260/A230、片段主峰、内参dPCR结果、是否合格。只有全部指标满足要求，才进入dPCR反应体系配制。若某一指标不合格，应优先排查抑制剂残留和片段完整性，而不是盲目增加模板量——增加模板量往往同时引入更多抑制剂，反而使定量结果更差。
总结来说，适用于dPCR的样本前处理应围绕“低抑制、短片段、可定量”三个目标展开：根据样本类型选择匹配的提取方法，在裂解和洗涤阶段充分去除抑制剂，根据目标扩增子长度控制片段化程度，最后用浓度、纯度、片段和功能四类指标综合判断提取质量。只有把前处理做扎实，后续的微滴生成、扩增和计数才能给出可信的绝对定量结果。