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重组DNA构建与分子验证工程

共计 30 章节
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01
重组DNA构建工程总览
目标=课程目标 · 重组DNA构建与分子验证的核心任务 · 典型工程流程
DNA重组
02
目标基因获取与序列设计
目标=从数据库检索目标基因 · 密码子优化原则 · 引物设计要点
目标基因获取序列设计
03
载体选择与功能元件解析
目标=克隆载体 · 表达载体 · 穿梭载体与整合载体的适用场景
载体选择功能元件解析
04
DNA片段扩增与制备
目标=PCR扩增目标片段 · 高保真酶选择 · 产物纯化
DNA片段扩增
05
限制性内切酶消化与片段处理
目标=酶切位点选择 · 双酶切策略 · 末端补平与去磷酸化
限制性内切酶消化片段处理
06
连接反应与重组构建
目标=T4 DNA连接酶反应条件 · 插入片段与载体比例优化 · 连接效率评估
连接反应重组构建
07
同源重组与无缝克隆
目标=同源臂长度设计 · 重组酶体系选择 · 多片段组装
同源重组无缝克隆
08
感受态细胞制备与转化
目标=化学转化与电转化原理 · 感受态细胞制备流程 · 转化效率影响因素
感受态细胞制备转化
09
重组子初步筛选
目标=抗生素筛选 · 蓝白斑筛选 · 菌落PCR
重组子初步筛选目标=抗生素筛选
10
质粒提取与质量评估
目标=碱裂解法 · 柱纯化法 · 质粒浓度与纯度测定
质粒提取质量评估
11
限制性酶切图谱验证
目标=单酶切与双酶切验证 · 片段大小预测 · 图谱比对
限制性酶切图谱验…目标=单酶切
12
PCR验证策略
目标=插入片段PCR · 菌落PCR · 跨接头PCR
PCR验证策略
13
测序验证与序列分析
目标=Sanger测序样品准备 · 测序结果读取 · 序列比对
测序验证序列分析
14
定点突变与基因编辑构建
目标=重叠延伸PCR · DpnI消化 · 突变引物设计
定点突变基因编辑构建
15
基因敲除与敲入载体构建
目标=同源臂设计 · 筛选标记选择 · CRISPR辅助构建
基因敲除敲入载体构建
16
多片段组装与通路构建
目标=Gibson组装 · Golden Gate组装 · 多基因通路构建
多片段组装通路构建
17
表达载体构建与宿主适配
目标=原核表达载体 · 真核表达载体 · 启动子与宿主匹配
表达载体构建宿主适配
18
蛋白表达初步检测
目标=诱导表达 · SDS-PAGE · Western blot
蛋白表达初步检测目标=诱导表达
19
重组蛋白纯化与验证
目标=亲和标签纯化 · 离子交换 · 分子筛
重组蛋白纯化验证
20
RNA相关重组构建与验证
目标=shRNA · siRNA · miRNA载体构建
RNA相关重组构建
21
病毒载体构建与包装验证
目标=慢病毒 · 腺相关病毒载体设计 · 包装质粒配比
病毒载体构建包装验证
22
基因组整合与稳定细胞系构建
目标=转座子 · 慢病毒整合 · 定点整合
基因组整合稳定细胞系构建
23
重组DNA构建中的常见错误与排查
目标=酶切不完全 · 连接失败 · 转化效率低
DNA重组
24
高通量克隆与自动化构建
目标=自动化液体处理 · 条形码引物 · 高通量筛选
高通量克隆自动化构建
25
分子验证的数据记录与可追溯性
目标=实验记录规范 · 样品编号 · 测序文件管理
分子验证的数据记…可追溯性
26
重组DNA构建的生物安全与合规
目标=生物安全等级 · 转基因生物管理 · 废弃物处理
DNA重组
27
真实项目案例一
目标=单基因表达载体构建与验证 · 关键节点决策 · 问题解决实例
真实项目案例一目标=单基因表达…
28
真实项目案例二
目标=多基因代谢通路组装与验证 · 通路表达平衡 · 中间体检测
真实项目案例二目标=多基因代谢…
29
真实项目案例三
目标=CRISPR敲除细胞系构建与分… · 载体构建 · 单克隆筛选
真实项目案例三CRISPR
30
重组DNA构建与分子验证工程总结与前沿
目标=核心技能整合 · 项目复盘 · 新技术趋势
DNA重组