SNP功能预测工具：SIFT、PolyPhen-2、PROVEAN的原理与使用方法

做SNV/SNP功能预测，有三把常用的筛子——SIFT、PolyPhen-2和PROVEAN。我刚接触这个领域时，习惯三个工具全跑一遍，然后取交集。后来发现，搞清楚每个工具背后的逻辑，比盲目堆工具重要得多。你想想看，如果不知道它们在看什么，结果冲突时你该信谁？

SIFT——从序列保守性入手

SIFT的核心思想很直接：一个氨基酸位点在进化中越保守，换成别的氨基酸就越容易出问题。它拿你的变异位点去做多序列比对，统计每个位置上各种氨基酸出现的频率，然后算一个0到1之间的分数。分数越低，保守性越强，变异越可能有害。阈值基本固定在0.05。

我在项目中遇到过一种情况：某个变异SIFT score是0.06，刚好卡在阈值上面。这时候别急着下结论说"无害"。我建议先看看这个位点的多序列比对质量，如果覆盖的物种很少，分数可能不太可靠。嗯，这里要注意辅助证据。

使用方式

SIFT最方便的用法是通过网页提交，适合单个变异分析：

1. 打开 SIFT 网页服务器
2. 输入蛋白序列或 UniProt ID
3. 指定变异位点和氨基酸替换
4. 提交，等待结果

批量分析可以用SIFT 4G的本地版本：

java -jar sift4g.jar -d /path/to/uniref100.fasta \
    -i input.vcf -o sift_output.txt

首次使用要对参考基因组建索引，这一步比较耗时。我记得第一次跑的时候没看文档，直接报错了——后来发现是数据库路径没配对。

PolyPhen-2——序列+结构，双管齐下

PolyPhen-2比SIFT多了一个维度：它不光看序列保守性，还把蛋白结构信息加了进来。说白了，它不光问"这个位置变没变过"，还问"这个位置在结构上重不重要"。底层用的是朴素贝叶斯或随机森林，输入特征包括进化保守性、结构域注释、理化性质变化等。输出是一个概率分数，越接近1，表示有害的可能性越大。

它提供两个模型：HumDiv和HumVar。HumDiv适用于罕见变异，HumVar用于常见变异筛查。我个人习惯两个模型都跑一下，如果结论一致，可信度就高很多。有一次分析一个膜蛋白的突变，HumDiv判有害，HumVar判中性——后来查文献发现这个位点确实有争议。

使用方式

网页版适合单查，界面很直观：

https://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/

批量分析可以用命令行版本：

polyphen-2 --query variants.txt \
    --output result.html \
    --model HumDiv

输入文件格式要求比较严，每行需要包含染色体、位置、参考等位基因和突变等位基因。我建议先用VCF转一下，别手写。

PROVEAN——同源比对的另一种计算思路

PROVEAN的思路跟SIFT有点像，但计算方式不同。它通过比对突变序列与同源序列，算一个delta对齐评分——简单说，就是看突变前后的序列跟同源序列的匹配程度变化了多少。评分是负值，低于-2.5就判定为有害。

这个阈值我试过好几个数据集，表现都挺稳定。不过要注意，PROVEAN对输入序列的质量很敏感。我在项目中遇到过一个问题：query序列里有几个 ambiguous 残基，provean直接跳过了那几条比对，导致评分失真。

使用方式

命令行工具很成熟，适合集成到pipeline里：

provean.sh -q query_protein.fa \
    -v variants.txt \
    -o provean_output

variant文件格式要求严格，每行必须严格按照"氨基酸位置 原始氨基酸 突变氨基酸"来写：

105 R W
207 G V
314 L P

网页版同样支持单个查询，适合快速验证。

三工具核心对比