2. 空间转录组学基础：技术发展史与主流平台
2.1 从原位杂交说起
空间转录组学，说白了就是给基因表达加个位置信息。传统 RNA 测序把组织磨碎了，基因表达量测得很准，但细胞在哪、邻居是谁，全丢了。
早期大家靠原位杂交（FISH）来定位 RNA。用荧光标记的探针，一个基因一个基因地看。我读博时还在这么干，一张切片只能看三五个基因，还累得眼睛疼。
为什么会这样？因为荧光光谱严重重叠，轮数多了样本就降解了。你想想看，想看一千个基因，得做几百轮成像，根本不现实。
转折点发生在 2010 年后。高通量测序和成像技术同时爆发，三条技术路线陆续成熟。
2.2 三大核心技术路线
我把它们分成三类：原位测序、空间条形码、多重单分子成像。三条路各自解决了不同的问题。
2.2.1 原位测序——在组织里直接读基因
原位测序（ISS）的思路很简单：直接在组织切片上进行测序反应。RNA 原位逆转录成 cDNA，然后通过滚环扩增（RCA）把信号放大，再用测序化学读取序列。
我第一次跑原位测序实验时，被自发荧光折磨得够呛。组织里的胶原纤维、红细胞，全在乱发光。后来摸索了光谱拆分和信号过滤，才算把真实信号捞出来。
代表方法包括 FISSEQ、CosMx（商业化平台）。这类技术的核心优势是单细胞甚至亚细胞分辨率，适合看 RNA 的精细定位。
2.2.2 空间条形码——给每个位置贴个门牌号
空间条形码的思路完全不同。它不是在组织里测序，而是用一块带有位置条形码的捕获芯片，把 RNA 从组织上"吸"下来，再通过条形码反推位置。
我最早用 10x Visium 时，透化时间调了好几轮。时间短了 RNA 释放不够，时间长了组织碎片掉进芯片，背景高得没法看。嗯，透化这一步是关键。
一个典型的 10x Visium 空间条形码长这样：
# 10x Visium 空间条形码片段 (16bp + UMI)
CGACGTACGTACGTAC-AAAAAAAAAA # bead 位置: (x=100, y=200)
TGCAACTGCAACTGCA-AAAAAAAAAA # bead 位置: (x=101, y=200)
GCTAGCTAGCTAGCTA-AAAAAAAAAA # bead 位置: (x=102, y=200)
ACGTACGTACGTACGT-AAAAAAAAAA # bead 位置: (x=103, y=200)每个 bead 上的条形码是唯一的，测序后根据条形码就能知道 RNA 来自哪个 spot。这类技术的代表是 10x Visium、Slide-seq、HDST。
2.2.3 MERFISH——像弹钢琴一样编码基因
MERFISH 是多重单分子 FISH 的进化版。它给每个基因分配一个二进制编码（比如 16 轮成像中，哪些轮发光，哪些轮不发光），然后通过多轮成像解码。
我曾帮一个神经科学团队搭建过 MERFISH 分析流程。最头疼的是图像配准，16 轮成像，样本在载物台上进进出出，每轮都有微小的位移。不做亚像素配准，解码错误率直接飙到 20% 以上。
MERFISH 的编码方案长这样：
# MERFISH 16轮编码方案（前三轮，部分基因）
GeneA: 1_1_0_0_1_1_0_0_1_1_0_0_1_1_0_0
GeneB: 1_0_1_0_1_0_1_0_1_0_1_0_1_0_1_0
GeneC: 1_1_1_1_0_0_0_0_1_1_1_1_0_0_0_0
GeneD: 1_0_0_1_0_1_1_0_1_0_0_1_0_1_1_0编码距离设计很关键。两个基因的编码如果太相似，成像噪声一大就容易混淆。所以编码本要用汉明距离 ≥ 4 的纠错码，这是 MERFISH 能保持低错误率的秘密。
这类技术的代表还有 seqFISH+、CosMx（也结合了原位测序）。
2.3 主流平台横向对比
下面这个表我建议你存一下。选平台时翻出来看看，很管用。
| 平台 | 技术原理 | 分辨率 | 基因通量 | 组织兼容 | 核心优势 | 主要局限 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 10x Visium | 空间条形码 | 55 μm | 全转录组 | FFPE / 新鲜 | 商业化成熟，流程标准 | 分辨率低，单 spot 含多个细胞 |
| Slide-seqV2 | 空间条形码 | 10 μm | 全转录组 | 新鲜冷冻 | 分辨率高，接近单细胞 | 覆盖均匀性不如 Visium |
| HDST | 空间条形码 | 2 μm | 全转录组 | 新鲜冷冻 | 亚细胞分辨率 | 通量低，实验难度大 |
| MERFISH | 多重单分子 FISH | 单细胞 | ~500 基因 | 新鲜冷冻 | 单细胞分辨率，定量准确 | 基因数受限，设备成本高 |
| seqFISH+ | 多重单分子 FISH | 单细胞 | ~10000 基因 | 新鲜冷冻 | 超高多重，接近全转录组 | 60 轮成像，实验极其繁琐 |
| CosMx | 原位测序 | 亚细胞 | ~1000 基因 | FFPE / 新鲜 | 支持 FFPE，分辨率高 | 通量有限，每视野基因数固定 |
我的经验总结： 空间条形码类平台适合做全转录组发现，MERFISH 和原位测序适合靶向验证和精细定位。两个方向不冲突，很多文章是先用 Visium 粗筛，再用 MERFISH 或 CosMx 验证。
2.4 怎么选？我给的建议
选平台是个权衡问题。我个人习惯是根据研究问题倒推：
- 想做全转录组发现，预算有限 → 10x Visium。55 μm 分辨率能看出组织区域差异，适合肿瘤微环境、发育图谱这类尺度的问题。
- 分辨率必须到单细胞 → Slide-seq 或 HDST。但要注意组织必须新鲜冷冻，FFPE 样本做不了。
- 目标基因已知，想精确定量 → MERFISH 或 CosMx。尤其是 FFPE 样本，CosMx 是目前少数能做的平台之一。
- 想做超高多重又不在乎实验复杂度 → seqFISH+。60 轮成像，不是每个实验室都扛得住。
一个小技巧： 拿不准的时候，先翻几篇用同类型组织 + 同平台的文章，看看别人的数据质量。公共数据库（如 Spatial Liver Atlas、Human Cell Atlas）里也能找到很多参考数据集，下载下来跑一跑再决定。
避坑指南： 我曾经在数据整合时踩过一个坑——不同平台的数据直接比较。10x Visium 的 55 μm spot 和 MERFISH 的单细胞分辨率，空间尺度差了 5 倍，直接比较会得出荒谬结论。跨平台比较前，一定要做空间分辨率对齐和批次校正。
空间转录组技术还在快速迭代。10x Visium 的分辨率在升级，MERFISH 的基因通量在提升，原位测序在往全转录组方向走。你想想看，三年前选平台和现在选平台，答案已经不一样了。保持关注技术更新，但更重要的是：先搞清楚你的生物学问题是什么。