📚 课程目录第2章空间转录组数据获取与预处理

空间转录组数据获取与预处理：常见平台、数据格式、质量控制

空间转录组这两年有多火，不用我多说。但很多人拿到数据就急着跑模型，结果发现结果一团糟。原因在哪？数据预处理没做好。说白了，空间转录组的数据比单细胞数据多了一个空间坐标维度，质量控制也要跟着变。今天我就把数据获取、格式转换和质控这一套流程帮你理清楚。

一、常见平台：你选哪个？

市面上主流的空间转录组平台大概有五六种。每个平台的数据结构、分辨率、通量都不一样。我个人经验是：选平台之前先想清楚你要回答什么生物学问题。

平台	分辨率	通量	RNA捕获方式	特点
10x Visium	~55 μm 点	中等（~5000 点/切片）	poly-A 捕获	最成熟，分析生态好
Slide-seq V2	~10 μm 珠子	高（~100k 珠子）	随机引物	分辨率高，但文库复杂
MERFISH	亚细胞级	中等（~10000 基因）	原位杂交 + 成像	单分子分辨率，需定制探针
STARmap	亚细胞级	低（~1000 基因）	原位测序	无需解离，适合神经科学
Seq-scope	~1 μm 点	极低	随机引物	超高点阵，适合精细结构

威宁：其实选平台还要看你的预算和样本类型。比如组织切片质量不好，MERFISH的背景荧光会比较刺眼，我踩过这个坑。

二、数据格式：别被后缀名吓住

拿到数据的第一步，先搞清楚文件从哪来、后缀名啥意思。10x Visium 输出的一组文件最常见：filtered_feature_bc_matrix.h5、spatial/tissue_hires_image.png、spatial/tissue_positions_list.csv。这里有个小陷阱：h5版本和mtx版本在内存使用上有区别，我建议你直接用h5，省空间。

核心数据文件类型
h5 (HDF5)：存储表达矩阵+特征+条形码，单文件方便
mtx (Market Matrix)：三个文件 (matrix.mtx, barcodes.tsv, features.tsv) 古老但兼容
CSV/TSV：文本格式，可读但体积大
JSON/GeoJSON：空间坐标和元数据，Slide-seq常用
TIFF/OME-TIFF：组织染色图或荧光图像

我曾经遇到一个团队，给了我一堆CSV文件每个超过2GB，光读取就崩了。后来发现他们用了一个非标准封装。建议你先用h5ls查看h5结构，确认key名。

下面是一个简单的读取示例，我一般用scanpy来加载Visium数据：

import scanpy as sc

adata = sc.read_visium(
    path="path_to_data_directory",
    count_file="filtered_feature_bc_matrix.h5",
    load_images=True
)
print(adata)
# AnnData object with n_obs × n_vars = 4433 × 34553
#     obs: 'in_tissue', 'array_row', 'array_col'
#     var: 'gene_ids', 'feature_types', 'genome'
#     obsm: 'spatial'

对于Slide-seq的数据，我习惯先用pip install slidseq（注意不是官方包，是社区工具），然后读取重格式。嗯，这里需要留个心眼：每个平台的坐标系统不一样，Visium是array_row/array_col + 像素坐标，Slide-seq是beads_coords，混着用会搞混空间关系。

三、质量控制：别让垃圾数据毁掉模型

空间转录组的QC和单细胞有相似之处，但多了空间层面的检查。我个人习惯把质控分成三个步骤：分子水平、点/珠子水平、空间一致性。千万别漏掉空间一致性检查，很多异常点虽然分子数正常，但空间分布明显与组织边界不齐。

3.1 常用指标

指标	含义	筛选范围
n_genes_by_counts	每个点检测到的基因数	通常 >200， <5000
total_counts	每个点的UMI总数	通常 >1000， <= 数据95%分位
pct_counts_mt	线粒体基因占比	一般 <20%
doublet_score	双胞可能性（非必需）	依赖方法，scrublet可做
spot_density	相邻点表达相关性	低密度点需排除

注意：不要直接套用单细胞QC的过滤阈值。空间转录组中组织边缘的点基因数本身偏低，但可能恰好是结构边界。我建议你做“分区域过滤”——先通过组织染色图像划分组织区域，再在该区域内做QC。

3.2 实战：10x Visium 过滤流程

我通常这样操作：

import scanpy as sc
import matplotlib.pyplot as plt

# 1. 计算QC指标
sc.pp.calculate_qc_metrics(adata, expr_type='counts', 
                            qc_vars=['mt'], 
                            percent_top=None,
                            log1p=False)

# 2. 定义过滤
adata.obs['mt_frac'] = adata.obs['pct_counts_mt']
adata = adata[adata.obs['mt_frac'] < 20, :]
adata = adata[adata.obs['n_genes_by_counts'] > 200, :]
adata = adata[adata.obs['total_counts'] > 1000, :]

# 3. 空间一致性检查：计算局部莫兰指数
import squidpy as sq
sq.gr.spatial_autocorr(adata, 
                        genes=['Hpca', 'Tbr1'], 
                        n_perms=100)
# 低显著性区域（p值>0.05）可能有问题

遇到低表达区域，不要急着删，先看看组织染色图。我有一次发现某个区域基因数很低，但所有点都在同一血管周围，最后确认是血管周围存在大量RNA降解。这时候应该保留但不能参与后续建模。

3.3 平台特有的“雷区”

Visium：注意in_tissue列，只有标签为1的点是有效组织区域。
Slide-seq：空珠子容易误判为有信号，建议用总UMI阈值 + 背景模型剔除。
MERFISH：背景荧光导致假阳编码，需要用spot quality筛选。
STARmap：成像漂移导致坐标偏移，必须做配准。

小技巧：不管你用哪个平台，建议输出一张QC violin plot + spatial scatter plot多模态图。一个维度看统计分布，另一个维度看空间分布，两个同时“有问题”的spot才应该排除。

四、知识体系总览：一张图看懂

下面这张流程图总结了从数据获取到预处理、质控的完整链路。我工作时都会贴在墙上当备忘录。

这张图里我把质量控制拆成三个互相独立但需要交叉验证的步骤。分子QC关注点的测序深度、线粒体占比；空间QC看点的空间邻居关系；一致性QC则跨模态对比组织轮廓。我的经验是：永远先跑一次全流程，再根据第一次的QC统计量调整阈值，至少迭代两轮。

五、常见坑及避坑指南

坑一：直接过滤低基因数点——组织边缘点基因数低但包含重要边界信息。
避坑：结合HE染色图像做视觉验证。
坑二：忽略批次效应——同一个实验不同切片之间也有批次效应，需要在QC阶段做初步校正。
避坑：运行sc.pp.regress_out()去除切片ID变量。
坑三：5万个点全保留——计算代价高，且大量无信号点会稀释空间信号。
避坑：先去除in_tissue=0或背景珠子，再降采样到合理数量。

我曾经接手一个项目，10x Visium数据里有30%的点在组织外，但是因为当初没有标记in_tissue，结果聚类时这些点自成一群。折腾了两周才发现。所以拿到数据第一件事就是看obsm['spatial']里每个点的坐标是否落在组织轮廓内。

建议预处理清单：

确认平台和版本（10x Visium v1 vs v2 差异大）
读取所有文件并生成汇总报告
运行标准QC指标（n_genes, total_counts, mt%）
手动检查前100个异常点空间分布
保存两个版本：原始备份 & 过滤后备份

嗯，基本上预处理到这个程度就够喂给下游模型了。后续模型搭建阶段，你还会遇到批次校正、数据标准化这些事，但那是后话。数据干净了，模型至少赢了一半。