📚 课程目录第4章质量控制与预处理

4. 质量控制与预处理：FastQC、MultiQC与数据清洗

拿到RNA-seq原始数据（FASTQ文件），第一件事不是急着跑比对。说实话，我见过太多人直接跳过这一步，结果下游分析全是垃圾。质量控制是整条分析管线的基石，这一步稳了，后面才能踏实。

你会问：原始数据到底能有什么问题？很多。测序仪偶尔会犯糊涂，接头序列没切干净，碱基质量在read末尾跳水，甚至样品标签（barcode）都可能是乱的。这些问题不提前处理，后续的特征学习全是噪声。

我个人习惯的处理管线分三个环节：先用FastQC扫一遍每个样本，然后用MultiQC把几十个样本的报告合并起来对比，最后根据报告做数据清洗。这条流水线我跑了不下上百次，稳稳的。

4.1 用FastQC给数据“体检”

FastQC是业界最通用的质检工具。它不修改数据，只读取FASTQ文件，输出一份包含十几个质量指标的HTML报告。

安装与运行：

FastQC用起来极其简单，一行命令搞定：

fastqc sample_1.fastq.gz sample_2.fastq.gz -o ./qc_reports/ -t 4

sample_1.fastq.gz：输入文件，支持gzip压缩格式
-o ./qc_reports/：输出目录
-t 4：用4个线程并行跑，大项目时很管用

跑完后每个样本会生成一个.html报告和一个.zip压缩包。只保留HTML就行，zip可以删掉。

关键指标解读：

报告默认会打开「Per base sequence quality」这个模块，这是最重要的一个图。它按read的每个位置画箱线图，黄色背景表示良好区间（Q > 28），红色背景表示拒绝区间（Q < 20）。如果后半部分的箱线图扎进了红色区，基本可以断定read质量在衰减。

我重点关注这几个模块：

模块名称	检查什么	常见警告原因
Per base sequence quality	每个碱基位置的平均质量分数	测序反应后期酶活性下降
Per sequence GC content	每条read的GC含量分布	污染或文库扩增偏差
Adapter Content	接头序列是否残留	建库时接头切得不干净
Overrepresented sequences	是否存在异常高丰度的序列	接头二聚体或PCR重复

我的小技巧： 先看「Per base sequence quality」和「Adapter Content」这两个模块。如果它们都亮了绿灯，其他模块大概率也没问题。我没必要一口气看完所有图。

4.2 用MultiQC批量“会诊”

当你有几十个样本时，一个个打开FastQC报告太折磨了。MultiQC能读取FastQC输出，把所有的图表聚合到一份交互式HTML报告里。

一条命令汇总：

multiqc ./qc_reports/ -o ./multiqc_report/

MultiQC会自动扫描qc_reports/目录下的所有FastQC产出，包括那些zip文件和html文件。输出一个multiqc_report.html，非常好用。

MultiQC比FastQC强在哪？

它支持横向对比。举个例子，「Per sequence GC content」这个图在单样本报告里就是一条曲线，但在MultiQC里能把所有样本的曲线叠在一起。如果某条曲线明显偏离全局分布，往往意味着那个样本有问题——污染、建库失败或样品搞混了。我记得有一次跑完MultiQC，发现有两个样本的GC曲线跑到45%去了，跟其他样本的曲线完全分家。后来一查，原来是文库制备时混入了细菌DNA。

  核心用法： 打开MultiQC报告的「General Statistics」表格，按「% GC」和「Total Sequences」排序。这两个字段能快速帮你定位异常样本。

4.3 数据清洗——把脏数据“洗”干净

看完报告，心里有数了，接下来动手处理。常用的工具有Trimmomatic、cutadapt、fastp。我个人偏向用Trimmomatic，因为它稳定且功能全，一个工具就能搞定去接头、滑窗裁剪、长度过滤等所有操作。

Trimmomatic典型流程：

java -jar trimmomatic-0.39.jar PE \
  sample_R1.fastq.gz sample_R2.fastq.gz \
  sample_R1_clean.fastq.gz sample_R1_unpaired.fastq.gz \
  sample_R2_clean.fastq.gz sample_R2_unpaired.fastq.gz \
  ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10 \
  SLIDINGWINDOW:4:20 \
  MINLEN:36

这个命令看着参数多，我来拆开讲：

PE：双端测序模式（paired-end）。单端用SE
ILLUMINACLIP：去接头。后面的2:30:10表示允许2个错配、30分匹配阈值、10分palindrome模式阈值
SLIDINGWINDOW:4:20：滑窗裁剪。窗口4个碱基，平均质量低于Q20就切除
MINLEN:36：扔掉裁剪后长度不足36bp的read

注意： 双端数据会输出4个文件。两对_clean文件是两端都保留下来的read对；两个_unpaired文件是一端被丢弃、另一端还是好数据的read。下游分析只用_clean文件，_unpaired可以归档备查。

参数调优：

参数不是死的。我一般根据FastQC的报告来微调：

FastQC问题	Trimmomatic参数调整
接头残留（Adapter Content亮红灯）	提高`ILLUMINACLIP`的匹配严格度，比如加大`2:20:10`
read末尾质量跳水	提高`SLIDINGWINDOW`阈值到`4:25`，切掉更多低质量尾段
短read比例偏高	提高`MINLEN`，比如调到`50`或`70`

避坑指南： 我曾经一次性把滑窗阈值调得太严（比如4:30），结果清洗后只保留下60%的read。清洗不是丢得越多越好，要在质量和保留率之间取平衡。建议先用1-2个样本试跑，确认参数合理后再批量跑完。

4.4 清洗后验证

清洗完不是结束，我要再做一轮FastQC验证。看看那些红色警告还在不在。正常的流程是：清洗前QC → 清洗 → 清洗后QC。如果清洗后报告里还是满屏红色，说明参数不对，得回头调整。

这一步虽然是工作量有点大，但绝对值得。数据洗干净了，后面的差异表达分析、聚类结果都会更稳健。

以上就是我处理RNA-seq质量控制的完整流程。从拿到原始数据到产出干净可用的FASTQ，其实花不了太多时间，但这个流程能帮你避开无数个后续分析的坑。数据干净了，后面做特征学习时，模型学到的才真正是肿瘤亚型的生物学信号，而不是测序误差的噪声。