4、输入数据准备：count 矩阵文件与样本注释（metadata）表格的格式要求、缺失值处理

好，咱们终于到了真正动手操作的部分了。我见过不少同学，从 RNA-seq 比对一路跑下来，结果一读到 DESeqDataSetFromMatrix 就报错——说白了，就是数据格式没对清楚。今天咱们就专门把输入数据的两个核心文件掰开了说。

其实你手头只需要两个东西：count 矩阵 和 metadata 表格。嗯，就这么简单。但格式上的坑，比想象中多。我当年第一次跑 DEseq2 时，因为 sample_id 里带了个减号，排查了一整个下午。来，咱们从最基础的说起。

4.1 count 矩阵——基因 × 样本的整数表格

count 矩阵长什么样？说白了就是一个纯整数的二维表：行是基因（或转录本），列是样本。矩阵里的每个数代表比对到该基因上的 reads 数目（或 fragments 数目）。

我建议你把数据存成 .csv 或 .tsv，列名直接用样本 ID（不要加奇怪的空格、连字符），行名用基因 ID（ENSEMBL ID、Entrez ID 或基因 symbol 都行，但要保证整个文件里不重复）。

一个标准 count 矩阵长这样（假装这是前 5 行）：

gene_id,sample1,sample2,sample3,sample4
ENSG00000121410,152,0,89,204
ENSG00000175899,0,33,12,0
ENSG00000233927,78,101,0,59
ENSG00000237683,220,47,155,88
ENSG00000268179,9,0,0,3

4.2 metadata 表格——样本 × 实验变量的注释表

metadata 表格是样本级别的信息。每一行是一个样本，每一列是一个实验变量（比如处理组、时间点、批次等）。

一个典型的 metadata 表格：

sample_id,condition,time_point,batch
sample1,control,0h,batch1
sample2,control,0h,batch1
sample3,treatment,2h,batch1
sample4,treatment,2h,batch2

列名要求	说明
列名不能包含特殊字符	避免空格、$、@、#、中文字符等。R 的列名会自动做一点转义，但手动写干净能省心太多。
因子（factor）列要注意顺序	处理组 vs 对照组，DESeq2 默认以第一水平为参考（reference level）。我建议用 factor(condition, levels = c("control","treatment")) 显式指定，避免按字母序排序。
缺失值处理	metadata 中允许出现 NA，但 不能出现在用于建模的列（比如 condition、batch）。如果一个样本的某个重要变量缺失，DESeq2 内部会直接丢弃该样本（deleting rows with missing values in design）。
行名与 count 列名一致	这是最常见的问题之一。我习惯先检查：all(colnames(counts) == rownames(metadata)) 返回 TRUE 再往下走。

4.3 缺失值该怎么处理？

好，重点来了。缺失值在 count 矩阵和 metadata 里的处理方式截然不同，咱们分开看。

• count 矩阵：零容忍。 如果某个基因在某些样本里没有读数（count=0），这完全正常，DESeq2 会用自带的正则化处理。但如果是空白单元格或 NA，DESeq2 直接罢工。你必须在导入前把那些位置填成 0，或者删掉该基因/样本。我个人倾向于填 0（如果这个基因在其他样本有表达）或者直接过滤掉那些低表达基因（用 rowSums(counts) > 10 之类的规则）。


• metadata：区分处理。
  1. 如果缺失值在 分组变量（condition、treatment）里：这个样本基本需要剔除，或者你确定自己知道该样本的真实组别就手动补上。
  2. 如果缺失值在 协变量（批次、时间）里：可以用中位数/众数填补，但一定要在分析报告中注明。更稳妥的做法是把这个样本扔掉，反正一个批次也就几十个样本。
  3. 如果缺失值在 数值型协变量（如年龄、体重）里：用输入均值或中位数填补；如果是离群值，可以考虑用回归填补。

4.4 整体流程：从原始文件到 DESeq2 输入

我把整个数据准备的过程画成了一张图，你跟着走一遍基本就不会出错了。

你顺着图走：先保证 count 矩阵的数值干净，再保证 metadata 的列名规范，然后处理两边的缺失值，最后校对行列一致性。走到最后一步，直接生成 DESeqDataSet 对象，基本不会再报格式错误。

4.5 实战 R 代码片段

放一段我平时用的导入检查流程，你可以直接套用：

# 读入 count 矩阵
counts <- read.csv("count_matrix.csv", row.names = 1)
# 读入 metadata
metadata <- read.csv("metadata.csv", row.names = 1)

# 1. 检查 count 矩阵数值类型
stopifnot(all(counts == floor(counts), na.rm = TRUE))
stopifnot(all(counts >= 0, na.rm = TRUE))
# 如果有 NA 直接报错
if (any(is.na(counts))) stop("count 矩阵中存在缺失值！")

# 2. 检查 metadata 缺失值
if (any(is.na(metadata$condition))) {
  warning("condition 列有缺失，将删除对应样本")
  samples_keep <- rownames(metadata[!is.na(metadata$condition), ])
  counts <- counts[, samples_keep]
  metadata <- metadata[samples_keep, ]
}

# 3. 样本对齐
common <- intersect(colnames(counts), rownames(metadata))
cat("共有", length(common), "个样本匹配\n")
counts <- counts[, common]
metadata <- metadata[common, ]

处理完这些，你就有了一个干净的数据集，可以直接喂给 DESeqDataSetFromMatrix。嗯，剩下的事就交给 DEseq2 吧。