📚 课程目录第3章注释工具VEP安装与配置

03 注释工具VEP安装与配置

嗯，咱们开始搞VEP。我第一次接触VEP是在一个全外显子组测序项目里，当时注释跑了一天一夜还没结束，后来发现是cache文件版本选错了。从那以后，我养成了一个习惯——装VEP之前先把环境要求和数据库版本理清楚。这一章，我就把这块经验掰开揉碎讲给你。

3.1 环境要求：别让硬件卡脖子

VEP其实不挑操作系统，Linux、macOS都行。我个人习惯在CentOS 7或Ubuntu 20.04上跑，稳定。Windows？我建议你还是装个WSL或者直接上虚拟机吧。

最低硬件要求：

CPU：2核起步，4核以上能提升并行效率
内存：8GB保底，32GB以上舒服（尤其处理全基因组时）
磁盘：50GB空闲空间，cache下载会占15-30GB

一个小技巧：如果你的服务器内存只有8GB，跑VEP时记得加 --fork 2 限制并行数，否则容易OOM。我以前在AWS的t2.medium上踩过这个坑。

软件依赖其实不多，但版本要卡死：

Perl >= 5.10（推荐5.26+）
zlib、curl、openssl 的基础库
BioPerl（可选，但装了能加速某些模块）
DBI、DBD::mysql（如果你要用数据库直连模式）

3.2 安装步骤：两种姿势任你选

安装VEP有两条路——走源码编译，或者直接用GitHub的release包。我倾向后者，省心。

3.2.1 最简单的做法：下载并运行安装脚本

# 创建目录
mkdir -p ~/tools/ensembl-vep
cd ~/tools/ensembl-vep

# 下载安装包
wget https://github.com/Ensembl/ensembl-vep/archive/release/110.tar.gz
tar xzf 110.tar.gz
cd ensembl-vep-release-110

# 一键安装
perl INSTALL.pl --AUTO a --SPECIES homo_sapiens --ASSEMBLY GRCh38

这里 --AUTO a 是全部自动安装，包含API、cache和FASTA文件。但说实话，我不建议你这么干——后面的数据库下载环节我会解释为什么。

3.2.2 我个人推荐的步骤

拆开装，更可控：

# 第一步：只安装核心脚本
perl INSTALL.pl --AUTO c

# 第二步：单独下载cache（后面会细讲）
perl INSTALL.pl --AUTO cf --ASSEMBLY GRCh38 --CACHEDIR /data/vep_cache

# 第三步：测试是否装好
./vep --help | head -20

记得测试一下，输出能看到VEP版本和基本参数就算成功。

注意： 如果你的网络需要代理，安装时会卡在curl下载那步。提前设置 export http_proxy=http://your_proxy:port，否则等到天荒地老。

3.3 数据库下载：cache与FASTA的玄机

搞VEP最难的不是安装，而是搞清楚到底要下哪些文件。我第一次搞的时候，下了个GRCh37的cache，然后用GRCh38的VCF去注释……结果可想而知。

VEP依赖两个核心数据源：

Cache：预先计算好的转录本、变异频率、保守性分数等
FASTA：参考基因组序列，用于获取参考等位基因

3.3.1 cache的选择策略

Ensembl提供了三种cache粒度，我整理成了一个表格：

cache类型	大小	包含内容	加载速度
`homo_sapiens_vep_110_GRCh38.tar.gz`	~15 GB	完整注释（基因、转录本、变异效应）	快
`homo_sapiens_vep_110_GRCh38_refseq.tar.gz`	~12 GB	RefSeq版本的注释	快
`homo_sapiens_vep_110_GRCh38_merged.tar.gz`	~18 GB	Ensembl + RefSeq 合并版	较快

我的建议是：

日常分析用 Ensembl cache，最稳定
如果项目要求用RefSeq ID，选 RefSeq cache
别碰merged cache，除非你清楚为什么要合并——我试过一次，后面处理重复转录本非常头疼

3.3.2 FASTA文件：必须和cache版本一致

很多人只下载cache，忘记下载FASTA。结果VEP注释时找不到参考等位基因，直接报错。FASTA文件通常不到1GB，但版本必须严格匹配：

# 下载GRCh38的FASTA（Ensembl版本）
wget ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-110/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.toplevel.fa.gz
gunzip Homo_sapiens.GRCh38.dna.toplevel.fa.gz

# 下载后创建索引
samtools faidx Homo_sapiens.GRCh38.dna.toplevel.fa

创建索引这一步经常被忽略。如果你不跑 samtools faidx，VEP也能用，但速度慢很多。我以前在集群上跑200个样本，没建索引跑了3天，建了索引压缩到8小时。

3.4 cache与VCF格式对应：别搭错桥

这是最大的坑。VCF的参考基因组版本必须和cache版本一一对应。我画了一张图帮你理解：

为什么会这样？因为VCF里的chr1和cache里的chr1可能不是同一个序列。GRCh38的chr1比GRCh37多了大约4.5Mb的组装填补——你想想看，用错误的参考基因组去注释，结果会差多远。

3.4.1 具体对应规则

VCF标注的参考基因组	VCF中的contig命名	应使用的VEP cache	FASTA来源
GRCh37 / hg19	1, 2, 3 ... X, Y, MT	`homo_sapiens_vep_110_GRCh37.tar.gz`	Ensembl GRCh37 FASTA
GRCh38 / hg38	1, 2, 3 ... X, Y, MT 或 chr1, chr2...	`homo_sapiens_vep_110_GRCh38.tar.gz`	Ensembl GRCh38 FASTA

检查你VCF版本的命令：

# 查看VCF头部的contig行
grep "^##contig" input.vcf | head -5

# 如果看到类似于 ##contig= 就是GRCh37
# 如果是 ##contig= 或没有chr前缀但length更大就是GRCh38

3.5 配置实战：一条完整的VEP命令

好了，假设你现在有cache、有FASTA、有VCF，来跑一次完整的注释。这是我项目中反复验证过的模板：

./vep \
  --input_file my_variants.vcf \
  --output_file my_variants_annotated.vcf \
  --cache \
  --cache_version 110 \
  --dir_cache /data/vep_cache \
  --fasta /data/reference/Homo_sapiens.GRCh38.dna.toplevel.fa \
  --species homo_sapiens \
  --assembly GRCh38 \
  --fork 4 \
  --offline \
  --vcf \
  --everything \
  --total_length \
  --no_stats

几个关键参数解释：

--offline：使用本地cache，不联网查询。我的线上环境都用这个，不然网络波动会导致注释中断
--everything：开启所有可用注释，包括SIFT、PolyPhen、gnomAD频率等。如果你只需要基本转录本注释，换成 --transcript_version 和 --regulatory 就行
--fork 4：用4个并行线程。我一般设为核心数的一半，留点资源给其他进程

避坑指南： 我曾经在跑大规模WGS数据时，没有加 --no_stats，结果VEP在统计汇总阶段占用了大量内存，导致作业被集群杀掉。加了这个参数后，稳定多了。

3.6 多物种支持（附赠技巧）

虽然咱们主要用人类数据，但VEP也支持小鼠、斑马鱼等。配置逻辑一样，只是cache名字换一下：

# 小鼠GRCm39
perl INSTALL.pl --AUTO cf --SPECIES mus_musculus --ASSEMBLY GRCm39

# 运行
./vep -i mouse_variants.vcf --species mus_musculus --assembly GRCm39

对了，不同物种的FASTA文件命名规则不同，下载时留意一下 dna.toplevel.fa.gz 还是 dna.primary_assembly.fa.gz。我一般选primary_assembly，它去掉了haplotypes，更干净。

注意： 如果你在同一个机器上跑多个物种，建议把它们放到不同的cache目录下，比如 /data/vep_cache/human 和 /data/vep_cache/mouse。然后通过 --dir_cache 指定。混在一起容易乱。

这一套下来，基本上VEP的安装和配置就不会出大问题了。记住核心三要素：版本对齐、cache完整、FASTA建索引——这三个点做到位，注释就能顺顺利利跑完。