📚 课程目录第3章输入文件格式

3、输入文件格式：AVinput格式详解

好，咱们开始聊 AVinput 格式。说实话，在我刚接触 ANNOVAR 那会儿，觉得这格式有点奇怪——既不是标准的 VCF，也不是常见的 BED。但用久了你会发现，ANNOVAR 之所以搞出这么个格式，就是为了省事。它把位置、碱基、等位基因信息全塞进几个列里，一行就搞定一个变异。

我个人习惯，拿到一批数据后，第一件事就是检查格式。因为格式错了，后面的分析全白搭。今天咱们就把 AVinput 的每一个字段掰开揉碎了讲清楚。

3.1 AVinput 格式长什么样

先看一个标准例子。一个 AVinput 文件，每行就是一个变异位点，用制表符（Tab）分隔。我建议你永远别用空格，否则 ANNOVAR 会直接报错。

chr1    948921  948922  A       G       NA12878 60      pass    .       .
chr1    949523  949524  T       C       NA12878 45      pass    .       .
chr1    950003  950004  G       A       NA12878 55      lowqual 0.01    .

说白了，这文件是个纯文本。你拿 Excel 打开，很可能把某些列变成科学计数法。别问我是怎么知道的……

3.2 每一列到底是什么意思

AVinput 固定要求前五列不能少。我整理了一张表，方便你对照着看。

列序号	列名	说明	示例值
1	染色体	支持 `chr1` 或 `1` 两种形式。需要与参考基因组保持一致	chr1
2	起始位置	1-based 坐标。注意不是 0-based 的 BED 坐标	948921
3	结束位置	对于 SNP，结束 = 起始 + 1。对于插入缺失，按真实长度算	948922
4	参考等位基因	与参考基因组完全一致。如果有多个碱基，用大写字母	A
5	替代等位基因	样本中检测到的变异碱基。可以跟参考一样（纯合参考）	G
6+	附加列	样本名、测序深度、质量值、过滤标签等。ANNOVAR 不强制，但数据库过滤会用	NA12878

提示：我刚开始时总把起始和结束搞反。记住——起始是1-based的坐标，结束是起始+1。对于SNP，其实它们差1。对于Indel，结束位置就是变异最后一个碱基的位置。

3.3 为什么要有起始和结束两列

你可能会问：SNP 明明就一个位点，为什么非要给两列？

嗯，这里有个历史原因。AVinput 设计时考虑了 Indel。假设你有一个三碱基的缺失：

chr1    1000    1003    ACT    .

起始是 1000，结束是 1003，参考碱基是 ACT，替代是点（表示缺失）。这样一来，ANNOVAR 内部就能准确定位到 Indel 的范围。如果是 SNP，那就写成起始和结束差 1 的形式。我见过不少人把 SNP 的结束写成和起始一样，结果 ANNOVAR 报了个错…… 那错误信息特别隐晦。

3.4 等位基因字段必须大写

这个坑我踩过。有一次从某个流程出来的 VCF 里，有的替代等位基因是小写的 a，我直接拿去做 AVinput 了。结果 ANNOVAR 不停报错说找不到参考序列——实际上就是大小写不匹配。

AVinput 要求参考和替代等位基因必须用大写字母。如果你是从 VCF 转换过来的，记得加一步 tr '[:lower:]' '[:upper:]'。

sed 's/\t[a-z]/\t\u&/g' input.txt > fixed_input.txt

警告：某些数据库（比如 dbSNP）在内部做了大小写归一化，但 AVinput 不会帮你做。大小写不一致，会造成该位点被跳过。我曾经因为这个丢掉了 3% 的变异，排查了一下午才发现。

3.5 附加列：它们是干什么的

前五列之后的东西，ANNOVAR 默认不关心具体含义。它只是把这些列原样保留到输出文件中。但你想想看，如果你不做质量控制，结果里一堆低质量的假阳性，数据库注释再全也是白搭。

我一般会留三列：

第6列：样本 ID。方便多样本合并分析
第7列：测序深度。低于 10× 的变异，我会标记为 low_depth
第8列：过滤标签。可以是 pass、lowqual、strand_bias 等

    实践建议：在送去 ANNOVAR 之前，先用 awk 或 python 过滤掉深度低于 8× 的位点。这样做有三个好处：减少假阳性、缩短运行时间、输出文件更小。我几乎每个项目都会加这一步。

3.6 从 VCF 转换成 AVinput

大部分时候你手里的数据是 VCF 格式。AVinput 跟 VCF 最大的区别：VCF 是 0-based 的，AVinput 是 1-based 的。千万别忘了加 1。

我这里有个随手用的脚本，分享给你做参考：

awk -F'\t' 'BEGIN{OFS="\t"} 
/^#/ {next}
{
    chr = $1
    pos = $2 + 1
    end = pos + length($4) - 1
    ref = $4
    alt = $5
    sample = "SAMPLE"
    qual = $6
    filter = $7
    print chr, pos, end, ref, alt, sample, qual, filter
}' input.vcf > input.avinput

注意这里有一个细节：$2 + 1 就是把 VCF 的 0-based 转成 AVinput 的 1-based。对于 SNP，end = pos 实际上就是起始位置；对于 Indel，它会自动算成正确长度。

3.7 格式验证的小窍门

文件写好了，别急着跑 ANNOVAR。先用这行命令快速检查：

awk -F'\t' '{
    if(NF < 5) print "Error: line " NR " has fewer than 5 columns";
    if($2 >= $3) print "Error: line " NR " start >= end";
    if(length($4) == 0 || length($5) == 0) print "Error: line " NR " empty ref or alt";
}' input.avinput

我在项目中遇到最多的问题是：Indel 的结束位置写错了。尤其是大片段缺失，你以为是 1000-2000，但 ANNOVAR 其实只要求覆盖缺失的两个端点。具体来说，先写缺失的起始位点，再写起始+1，参考等位基因写成完整的缺失序列，替代写成 - 表示的空白序列。

避坑：如果出现 WARNING: chromosome not found in reference 错误，百分之九十是因为染色体前缀不一致。比如参考基因组是 1，而你写了 chr1。用 sed 's/^chr//' 或 sed 's/^/chr/' 统一一下就行。

3.8 AVinput 的整体结构

下图把这章的知识点串在了一起。从原始 VCF 开始，经过格式转换、坐标调整、质量控制，最终生成干净的 AVinput 文件，送入 ANNOVAR 进行数据库注释。

3.9 我的日常检查清单

最后，分享一份我自己用的 AVinput 质量检查清单。每次跑 ANNOVAR 之前，我都会在终端跑一遍这些命令，心里才踏实。

检查染色体格式：awk -F'\t' '{print $1}' input.avinput | sort -u，确认跟参考基因组一致
检查位置逻辑：awk -F'\t' '$2 >= $3' input.avinput，不能有任何输出
检查等位基因：grep -i '[a-z]' input.avinput | head，确认没有小写字母
检查空值：awk -F'\t' 'length($4)==0 || length($5)==0' input.avinput，不能有输出
检查列数：awk '{print NF}' input.avinput | sort -u，确保每一行列数相同

嗯，能把这些都过了，你的 AVinput 文件就基本没问题了。剩下的就是丢给 ANNOVAR，等着拿结果了。