数据预处理：质量控制、过滤、归一化

好，咱们进入第3章。前面聊了怎么读数据、看数据结构，现在要动真格的了——对原始数据进行预处理。

我个人认为，这步是整个流程里最容易被低估的环节。很多同学一上来就跑什么批次校正、聚类，结果出来的图乱七八糟，回头一查，原来是原始数据里混了太多垃圾。听我一句劝，预处理做扎实了，后面80%的问题都不会出现。

3.1 数据概览：先摸清家底

拿到一个空间转录组数据集，别急着上脚本。先问问自己几个问题：

• 这是哪个平台的数据？10x Visium、Slide-seq还是MERFISH？
• 每个spot覆盖多少个细胞？
• 测序深度大概多少？UMI数分布怎么样？

我不建议大家直接写代码，先用手头的探索性工具看一看全局。比如用Seurat或者Scanpy快速画几个分布图。

如果你发现某个样本的UMI数中位数只有几百，另一个样本有上万，那后面必须做标准化，不然所有比较都白搭。

3.2 质量控制：把脏东西筛出去

质量控制说白了就是两个维度：一个是spot级别的QC，一个是基因级别的QC。但空间转录组有个特殊之处——你没法像单细胞那样直接看细胞活性，但你可以看spot的空间位置。

Spot级别的QC指标：

我建议的QC流程：

1. 总UMI数过滤：扔掉UMI数低于某个阈值的spot。阈值怎么定？看UMI分布曲线的拐点。一般在100-500之间。
2. 检测基因数过滤：检测到基因数太少的spot，可能是组织边缘或者空位。阈值通常在200-300。
3. 线粒体比例过滤：空间转录组我一般放到30%-50%，看具体组织类型。脑组织线粒体比例通常偏高，肝脏也是。
4. 空间异常点过滤：这点很多教程不提。有些spot虽然UMI数正常，但位置在组织边缘或者组织空洞里。如果有组织学图像，一定要结合来看。

# 伪代码示例：Seurat风格的QC过滤
# 假设你已经有了Seurat对象
spatial_obj[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(spatial_obj, pattern = "^MT-")

# 过滤条件
spatial_obj <- subset(spatial_obj, 
    subset = nCount_Spatial > 500 & 
             nFeature_Spatial > 200 & 
             percent.mt < 30)

等等，这里有个坑。上面这个过滤是全局一刀切，但空间转录组数据经常有批次差异。我遇到过两个批次的样本，UMI数分布差了两倍——一个批次中位数800，另一个中位数2000。这种时候一刀切就不合适了。

3.3 过滤：删除低表达基因

基因级别的过滤比单细胞简单。核心原则就一条：在整个数据集中表达量极低、检测率低的基因，删掉。

为什么要删？

• 减少计算量，你想想看几万个基因里90%都是0，算起来浪费资源
• 去除噪声，低表达基因容易被技术噪声放大
• 提高下游分析稳定性，比如归一化、PCA都对稀疏数据敏感

常见过滤策略：

策略	说明
最小表达spot数	基因至少在N个spot中有表达（count > 0）
最小总UMI数	基因在所有spot中的总表达量高于阈值
最大表达比例	删除在太多spot中都表达的基因（往往是housekeeping基因，没什么信息量）

# 过滤基因：至少在3个spot中有表达
# Scanpy风格
import scanpy as sc

adata.var["n_cells"] = np.sum(adata.X > 0, axis=0).A1
adata = adata[:, adata.var["n_cells"] >= 3]

# 或者用Seurat
# spatial_obj <- spatial_obj[rowSums(spatial_obj@assays$Spatial@counts > 0) >= 3, ]

3.4 归一化：让数据可比

归一化——这步我估计是争议最多的。

常规单细胞转录组里，我们通常用LogNormalize、SCTransform或者scran的pooling方法。空间转录组能不能直接用？能，但要小心。

空间转录组归一化的特殊之处：

• 每个spot的测序深度差异更大，因为spot覆盖的细胞数不均匀
• 空间邻居之间有生物学相关性，普通归一化可能放大局部噪声
• 有些归一化方法（比如SCTransform）会过度拟合某些批次效应

我常用的三种归一化方法对比：

方法	适用场景	优缺点
LogNormalize	快速探索、初步分析	简单、速度快；但无法处理深度差异极大的情况
SCTransform	需要更准确的方差估计时	效果好、保留更多生物变异；但计算量大、会过度校正某些批次
scran pooling	需要稳健的size factor估计	受异常值影响小；但空间数据不一定满足pooling假设

# 常见的归一化代码
# Seurat风格
spatial_obj <- NormalizeData(spatial_obj, 
    normalization.method = "LogNormalize", 
    scale.factor = 10000)

# SCTransform
spatial_obj <- SCTransform(spatial_obj, 
    assay = "Spatial", 
    variable.features.n = 3000)

这里我想专门提一下 SCTransform 的坑。它默认会做正则化负二项回归，把测序深度作为协变量回归掉。这个逻辑在单细胞里没问题，但在空间转录组里，测序深度和spot内细胞数正相关，而细胞数又和某些生物学特征（比如细胞密度、组织区域）相关。你一旦回归掉深度，可能连带着把生物学信号也去掉了。

怎么预防？我一般会同时跑一个LogNormalize版本和SCTransform版本，对比关键基因的表达模式。如果发现某个已知的区域marker基因在SCTransform版本里消失了，那可能就是过度校正了。

3.5 本章知识结构

下面这张图总结了本章的数据预处理流程，从原始数据到标准化数据之间的三步走：

你看，这个流程其实挺线性的。但实际项目里我经常要来回调整——比如过滤完之后发现某个基因没了，回头改QC阈值再跑一次。别怕重复，数据预处理就是这样。

3.6 避坑总结

嗯，最后总结几个我踩过的坑：

• 别用单细胞的QC阈值套空间数据。空间spot的线粒体比例普遍更高、UMI数分布更宽。强行套用会导致大量spot被误删。
• 过滤基因要留余地。有些基因在数据里表达很低，但可能就是你要找的稀有细胞marker。宁可多留几个让后面的方法去筛选，不要一刀切砍光。
• 归一化后要验证。我习惯对每个样本画一个归一化后的UMI分布图，如果某个样本明显偏离，说明scale factor或者方法选错了。
• SCTransform不是万能的。它会回归掉测序深度，而空间数据的深度和细胞数是关联的。深度差异本身可能就是生物学信号。用的时候多留个心眼。