📚 课程目录第2章必需字段详解

必需字段详解：seqid、source、type、start、end、score、strand、phase、attributes

GFF3的每一行，都必须包含这9个字段。

缺一个都不行。顺序也不能乱。

我刚接触GFF3那会儿，总以为这是搞形式主义。后来被坑过几次，才明白每个字段都有它的设计逻辑。

2.1 字段概览

先说整体结构。9个字段用制表符分隔，做成一列一列的样子。

字段名	类型	必填	占位符
seqid	字符串	是	无
source	字符串	是	.
type	字符串	是	无
start	正整数	是	无
end	正整数	是	无
score	浮点数	否	.
strand	字符	是	.
phase	整数	参见说明	.
attributes	键值对	是	无

这张表可以当速查卡用。

我习惯把它贴在终端旁边的墙上，编码的时候瞄一眼就行。

2.2 字段逐个拆解

下面一个一个讲。

每个字段我都会给出：官方定义、我的理解、常见错误。

2.2.1 seqid：序列标识符

这个字段就是告诉你，当前记录在哪个染色体或scaffold上。

我曾碰到有人把seqid写成"chr1"和"1"混着来。文件里一半是chr1，一半是1。结果下游工具当成两个不同的序列在处理，注释全乱了。

注意： seqid必须与FASTA文件头部名称严格一致。差异哪怕小到一个字符，都会造成对应关系断裂。

我的建议很简单。统一用同一个命名约定，大小写、前缀、连字符都要保持一致。

个人技巧： 用grep按seqid分组计数，快速排查不一致问题。

2.2.2 source：注释来源

这个字段描述注释的产生方式。可以是软件名、数据库名、或者实验方法。

比如Augustus、RefSeq、RNA-Seq_evidence。

如果不知道来源，就用点做占位符：.。

为什么重要？ 多源注释合并时，source字段可以帮你追踪每条记录的来源。这相当于一个"质检章"。

但我必须提醒你。source字段不要写太个性化的名字。

我见过有人写my_best_guess，虽然语法没问题，但别人根本看不懂。最好使用标准名称。

2.2.3 type：特征类型

这是核心字段。它指定这条记录是什么。比如gene、mRNA、CDS、exon。

类型名必须符合SO（Sequence Ontology）术语。GFF3官方推荐使用SO术语。但这不是强制性的。

不过我个人强烈建议遵守。否则兼容性会很差。

# 推荐写法
gene
mRNA
CDS
exon

# 不推荐写法（虽然能通过语法检查）
genetic_element
coding_region
transcript_unit

我在项目中遇到过使用自定义类型名的情况。结果下游工具解析时直接崩溃了。因为那种工具只认特定几个SO术语。从那以后我就再也不敢乱取名了。

2.2.4 start和end：坐标对

这两个字段定义特征在序列上的起止位置。

关键规则有两条：

坐标是基于1的整数。不是0基。
end必须大于等于start。

也许有人会问：为什么不是0基？

因为GFF3从GenBank格式继承来的一套规则。最早就是这么设计的。你想想看，生物学家习惯从1开始数碱基位置。所以GFF3遵循了这个习惯。

还有一个容易搞混的概念：区间类型。

区间	坐标示例	起始	终止
点特征	start=10, end=10	10	10
区间特征	start=10, end=20	10	20

常见坑： 点特征如果写错成start=10, end=11，虽然语法检查能通过，但代表一个长度为1的碱基区间。意义完全不同。

2.2.5 score：分数

这个字段可选。通常用于表示比对置信度或计算得分。

如果不使用，用点.占位。

典型用法如下：

# 比对得分
score=254.3

# 无得分
score=.

要注意的是，score不是自由格式的文本。必须是一个数字或点。我曾经看到有人写high和low。结果下游统计脚本直接炸了。

2.2.6 strand：链方向

这个字段告诉特征位于DNA的正链还是负链。

取值就3种：

+：正链
-：负链
.：不知道或不适用（链不明）

有一个很容易忽略的点：链方向影响CDS相位计算。

负链基因的外显子和CDS坐标，基因组浏览器内部会进行反向翻译。如果你手动调整坐标，很可能搞错。

我的经验： 尽量不要手动调整负链特征的坐标。除非你非常清楚自己在做什么。直接交给专业工具处理最稳妥。

2.2.7 phase：相位

这个字段只对CDS特征有意义。表示CDS的第一个碱基相对于密码子起始位置的偏移量。

取值只能是0、1、2或者点。

0：特征起始与密码子边界对齐
1：特征起始相对于密码子边界右移一个碱基
2：特征起始相对于密码子边界右移两个碱基
只用于CDS，其他类型用点占位

我遇到的最离谱的错误，是把负链的phase算错了。

负链CDS的phase计算是基于反向互补序列，而不是原始序列。很多人直接复用正链phase，结果翻译出来的蛋白质序列全错。

# 负链CDS的phase示例：第二个外显子phase=2
# 表示这个外显子起始处缺失两个碱基，才能对齐密码子

警告： phase错误会造成蛋白质序列翻译出错。而且这种错误非常隐蔽，如果不做翻译验证，可能在文件里藏很久才发现不了。

2.2.8 attributes：属性键值对

这个字段是最灵活，也是最多人出错的地方。

它是Key=Value;Key=Value的格式。多个键值对用分号分隔。

ID=gene001;Name=BRCA1;Note=tumor suppressor gene

属性键值对的编码规则：某些特殊字符需要进行Percent-Encoding（百分号编码）。

分号;需要编码为%3B
等号=需要编码为%3D
制表符、换行符也需要编码

我在项目中遇到过有人把Note=gene mutation写成了Note=splice variant;functional。因为分号没编码，解析器把functional当成了另一个键，直接解析出错了。

核心原则

推荐保留的键有：ID、Name、Parent、Alias、Note、Ontology_term、Dbxref。

ID必须是唯一的。Parent用于建立层次关系。

GFF3还有一个推荐但非强制的要求：ID值应该在整个文件中唯一。

虽然这不是语法错误，但多个特征共享同一个ID，下游工具往往会报错或忽略重复记录。

2.3 字段关系图

下面这张图能帮助你直观理解各个字段如何协同工作。

2.4 常见错误与避坑指南

下面我列出一些我实际踩过的坑。希望能帮你避免走弯路。

seqid不一致：FASTA头部和GFF3的seqid对不上。解决方案：做一次交叉验证。
坐标混淆：0基和1基混用。GFF3固定使用1基。转换时务必确认。
phase用错：负链CDS的phase需要基于反向互补序列计算。不要直接用正链的值。
属性键名冲突：同一个特征内出现重复的键名。虽然语法不禁止，但多数解析器会覆盖前面的值。
占位符与值的混淆：score和phase使用.占位，表示缺失。不要填NA、none或其他字符串。

检查清单 每次写完GFF3，可以跑一遍这个清单：
- seqid是否唯一且与FASTA匹配？
- start是否小于等于end？
- 负链CDS的phase计算是否正确？
- attributes是否做了百分号编码？
- ID是否全局唯一？

2.5 本章小结

9个字段，每个都有它的设计逻辑。

标识类字段帮你定位特征在哪里、由谁产生、是什么类型。

位置类字段告诉你特征的位置坐标和链方向。

属性类字段提供剩余的所有辅助信息。

只要把这三类字段搞清楚，GFF3的骨架就搭起来了。