DIANN质谱批次质控与分析报告 - 第3节 DIANN质谱批次质控与分析报告 - 第3节

📚 课程目录第3章 DIANN基础操作

# DIANN基础操作：命令行参数详解，输入文件格式（raw、mzML），库文件（spectral library）准备，输出文件介绍说实话，DIANN 这工具我刚接手时也挺头疼。参数看着多，其实核心就那几个。文件格式选不对、库文件没准备好，后面全是坑。这一章我把最基础的操作掰开揉碎了讲，都是实际用下来的经验。 ## 命令行参数详解 DIANN 的命令行设计其实挺直观。核心参数不多，但每个都得吃透。我刚开始用的时候，经常忘记设 `--threads`，结果跑起来慢得让人想砸电脑。先看一个最基础的命令：

diann --f sample.raw --lib library.tsv --out ./results --threads 16

这条命令做了三件事：加载 raw 文件，用 library.tsv 做谱图库，结果输出到 `./results` 目录，开 16 个线程跑。下面我把常用参数列个表： | 参数 | 说明 | 默认值 | |------|------|--------| | `--f` | 输入文件，支持通配符或逗号分隔 | 无 | | `--lib` | 谱图库文件（.tsv 或 .hl 格式） | 无 | | `--out` | 输出目录 | `./out` | | `--threads` | CPU 线程数 | 4 | | `--temp` | 临时文件目录 | 系统临时目录 | | `--fasta` | FASTA 文件，用于生成谱图库 | 无 | | `--min-fr-mz` | 前体最小 m/z | 300 | | `--max-fr-mz` | 前体最大 m/z | 1800 | | `--min-pep-len` | 最短肽段长度 | 6 | | `--max-pep-len` | 最长肽段长度 | 30 | | `--no-remap` | 禁用保留时间重映射 | false | | `--individual-mass-acc` | 个体质量精度模式 | false | `--threads` 这个参数，我特别想多说一句。很多人觉得设得越大越好，其实不是。我遇到过设成 64 线程结果内存直接爆掉的情况。一般来说，物理核心数的 1.5 到 2 倍比较稳妥。再看一个更完整的命令示例：

diann --f *.raw --lib library.tsv --out ./batch1_results \
  --threads 16 --temp ./tmp \
  --min-fr-mz 350 --max-fr-mz 1200 \
  --min-pep-len 7 --max-pep-len 35

我的习惯：先用 --threads 8 跑一个小样本测试，确认参数没问题再上全量数据。别一上来就全核开满，万一参数不对，重跑的时间够你喝一壶的。

## 输入文件格式：raw 与 mzML DIANN 支持两种输入格式：`.raw` 和 `.mzML`。说白了，raw 是 Thermo 的原始格式，mzML 是开放标准格式。我个人建议：**能用 mzML 就别用 raw**。为什么？mzML 是开源的，跨平台兼容性好。raw 格式在 Linux 上读起来很麻烦，有时候还得装额外的驱动。我在项目中吃过这个亏——服务器是 Linux 的，raw 文件传上去发现读不了，临时转 mzML 又花了半天。转换工具推荐 msconvert（ProteoWizard 套件），一条命令就搞定：

msconvert sample.raw --mzML --zlib --filter "peakPicking true 1-"

注意加上 `--zlib` 压缩，能省不少磁盘空间。峰 picking 那步也别省，不然 mzML 的质量会打折扣。

  如果你用 Windows 系统，raw 格式直接喂给 DIANN 没问题。但如果你用 Linux 或 macOS，趁早转成 mzML，省得到时候抓狂。

## 谱图库文件准备谱图库是 DIANN 的“灵魂”。没有库，它啥也干不了。DIANN 支持两种方式获取谱图库： - **直接提供谱图库**：`.tsv` 或 `.hl` 格式，包含肽段的保留时间、碎片离子信息等 - **从 FASTA 生成**：用 `--fasta` 参数，DIANN 会基于深度学习预测谱图库如果你手头有现成的谱图库，比如从之前 DDA 实验构建的，直接用就行。没有的话，用 FASTA 生成也很快。从 FASTA 生成库的命令：

diann --fasta human.fasta --out ./library --threads 16 --lib human_library.tsv

DIANN 会先预测谱图库，然后保存到 `human_library.tsv`。后续跑样本时，直接用这个库。

我曾经踩过的坑：FASTA 文件里夹杂了污染序列，结果生成的库乱七八糟，鉴定出大量不存在的肽段。所以，跑之前一定要检查 FASTA 的质量，最好用 clean FASTA。

谱图库的质量直接影响鉴定结果。我一般会用 **至少两个条件** 来评估库的好坏：肽段数量够不够、保留时间分布是否合理。如果库里的肽段数比预期少很多，八成是 FASTA 或参数有问题。 .hl 格式是 DIANN 的二进制格式，加载速度比 .tsv 快很多。如果你经常跑同一套库，建议转成 .hl 存着。 ## 输出文件介绍 DIANN 跑完后会生成一堆文件。很多新手看到那么多文件就慌了。其实核心就几个： | 文件 | 内容 | 用途 | |------|------|------| | `report.tsv` | 所有肽段的鉴定和定量信息 | 最常用的报告，做差异分析的基础 | | `report.pg_matrix.tsv` | 蛋白质组定量矩阵 | 蛋白质级别的定量，直接用于统计 | | `report.pr_matrix.tsv` | 前体离子定量矩阵 | 前体级别的定量，通常用于深度分析 | | `stats.tsv` | 运行统计信息 | 查看鉴定数量、FDR 等质控指标 | | `library.tsv` | 实际使用的谱图库 | 如果是从 FASTA 生成的库，会输出这个 | 我个人的工作流是：**先看 stats.tsv 检查质控指标**，过了关再用 report.tsv 做下游分析。report.pg_matrix.tsv 和 report.pr_matrix.tsv 是给统计软件（比如 MSstats）准备的，直接喂就行。

一个小技巧：report.tsv 文件通常很大，用 Excel 打开会卡死。我习惯用 R 或 Python 来读，实在要用 Excel 的话，先 filter 掉一些不重要的列再打开。