第2章：单细胞数据预处理：质控、标准化与整合基础

做单细胞分析的朋友都知道，拿到原始数据后第一步不是急着跑聚类或找 marker。你得先把数据洗干净。我个人习惯把预处理看成是给细胞做体检——不合格的细胞要剔除，信号要校准，不同批次的样本要能拉到一起比较。这套流程走顺了，后面的分析才不会翻车。

本章我们聚焦三个核心环节：质控（QC）、标准化（Normalization）和整合（Integration）。这三个步骤在批次效应诊断中是前置基础，也是你能不能在后续的 PCoA/UMAP 图上看出门道的关键。

2.1 质量控制：把好数据第一道关

质控说白了就是剔除那些「不健康」的细胞。你可能拿到 1 万个细胞，但里面混了不少空液滴、双细胞、或者快要裂解的烂细胞。如果不筛掉它们，后续的聚类和差异分析都会被污染。

我自己的标准流程一般看三个指标：

• UMI 数量（nCount_RNA）：太少可能是空液滴，太多可能是双细胞。
• 检测到的基因数（nFeature_RNA）：同样反映细胞复杂性。
• 线粒体基因比例（percent.mt）：超过 20% 通常说明细胞膜已破损。

# Seurat 标准质控流程
library(Seurat)

# 创建 Seurat 对象
pbmc.data <- Read10X(data.dir = "filtered_feature_bc_matrix/")
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, project = "pbmc3k", min.cells = 3, min.features = 200)

# 计算线粒体基因比例
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")

# 可视化 QC 指标
VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)

# 基于分布手动筛选
pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & percent.mt < 20)

2.2 标准化：让细胞间可比

标准化要解决的是测序深度差异。有些细胞捕获了 10 万条 UMI，有些只有 1 万条，不代表它们生物学上有本质不同。我们得把每个细胞的总表达量拉到同一个基准线上。

最常用的方法是 LogNormalize，也就是先对每个细胞的 UMI 计数做总表达量归一化，再乘一个缩放因子（默认 10,000），最后做 log1p 转换。它简单、稳定，适合新手入门。

# 默认标准化
pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)

# 等价于下面的手动操作（了解原理）
# norm_counts <- log1p(t(t(pbmc@assays$RNA@counts) / colSums(pbmc@assays$RNA@counts)) * 10000)

不过 LogNormalize 有个问题——它对高表达基因和低表达基因的方差影响不对称。做 PCA 的时候，高表达基因往往占主导地位。所以后来出现了 SCTransform，它用正则化负二项回归来建模 UMI 的均值和方差关系，可以更有效地去除技术噪音。

方法	核心原理	适用场景	速度
LogNormalize	总表达量归一化 + log1p	快速探索、小数据集	快
SCTransform	正则化负二项回归	大规模数据、批次结构复杂	稍慢
Pearson residuals	在 sctransform 内部使用	兼容下游 Harmony/CCA 整合	中等

2.3 特征选择：找到最会「说话」的基因

标准化之后，我们通常需要选出一批 高变基因（HVGs）。这一步是为了降维做准备——你想想看，2 万个基因里有一半在不同细胞间几乎不表达或表达恒定，它们对区分细胞类型毫无贡献。不如只挑波动最大的 2000~5000 个基因来做 PCA。

Seurat 默认用方差稳定化变换（VST）来选择 HVGs，其实跟 SCTransform 的思路一脉相承。你直接运行下面的代码就行：

# 识别高变基因
pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)

# 查看 top10 HVG
top10 <- head(VariableFeatures(pbmc), 10)
print(top10)

2.4 整合基础：当数据来自多个批次

好了，现在你手上有两个样本：一个是健康人的 PBMC，一个是病人的 PBMC。你分别做了质控、标准化、找 HVG，然后把两个 Seurat 对象合并。结果一跑 UMAP——健康的和病人的完全分成两团。

是真的生物学差异吗？还是批次效应？老实说，单细胞整合就是为了解决这个「疑案」。

整合（Integration）是用来对齐不同批次间的联合嵌入空间，保留生物学差异的同时消除技术批次效应。目前主流的方法有：

• CCA（Canonical Correlation Analysis）：找批次间共有的基因-细胞相关结构，然后通过「锚点（anchors）」来校正。
• Harmony：在 PCA 主成分空间上做软聚类和迭代校正，效率高、适合大规模数据。
• scVI：基于变分自编码器的深度学习方法，适合复杂批次结构。

下面是一个用 Seurat CCA 整合的标准流程：

# 两个 Batch 对象拆分
pbmc.list <- SplitObject(pbmc, split.by = "batch")

# 分别标准化并找 HVG
pbmc.list <- lapply(pbmc.list, function(x) {
  x <- NormalizeData(x, verbose = FALSE)
  x <- FindVariableFeatures(x, selection.method = "vst", nfeatures = 2000, verbose = FALSE)
})

# 找到锚点并整合
anchors <- FindIntegrationAnchors(object.list = pbmc.list, dims = 1:30)
pbmc.integrated <- IntegrateData(anchorset = anchors, dims = 1:30)

# 整合后的数据存在 'integrated' assay 中
DefaultAssay(pbmc.integrated) <- "integrated"

# 标准化 + 降维 + 聚类
pbmc.integrated <- ScaleData(pbmc.integrated, verbose = FALSE)
pbmc.integrated <- RunPCA(pbmc.integrated, npcs = 30, verbose = FALSE)
pbmc.integrated <- RunUMAP(pbmc.integrated, reduction = "pca", dims = 1:30)

你看，整合后的数据在 'integrated' assay 里，而不是原始的 'RNA' assay。这里我建议初学者务必记住：差异表达分析应该回到 'RNA' assay 做，而可视化可以用 'integrated' assay。

2.5 本章知识体系总览

下面我用一张流程图把今天讲的内容串起来。这张图覆盖了从原始计数到整合数据的全流程，你在做自己的项目时可以直接照着思路走。