实验流程：组织切片与放置
组织切片和放置这一步，说白了就是决定你最终能看到什么。我见过太多人花了大价钱做测序，最后因为切片这一步翻车——组织掉了、气泡没排干净、切面跟芯片对不上……那损失真不小。所以这一章我跟你聊聊我的操作习惯和踩过的坑。
3.1 组织包埋与冷冻
Visium 实验一般用 OCT 包埋剂来做冷冻包埋。我个人的习惯是先把组织块在 -80 °C 异戊烷里速冻 30 秒，然后迅速转入 -20 °C 恒温切片机。这样能最大限度减少冰晶形成——冰晶多了会刺破细胞结构，后面染色和捕获都会出问题。
我的小窍门：包埋前用纸巾吸一下组织表面多余水分，但别吸太干。水分残留会导致 OCT 与组织之间出现空隙，切片时整个组织会脱落。我吃过这个亏，后来每次都用滤纸轻轻蘸一下。
包埋时注意两点：一是 OCT 要完全覆盖组织，不要有气泡；二是组织块的摆放方向要垂直于刀片前进方向。你想想看，如果组织长轴跟刀片平行，切片时容易卷曲或者撕裂。
3.2 切片厚度与角度
Visium 官方推荐切片厚度为 10 µm。厚度太大 RNA 渗透效率会下降，厚度太小组织又容易碎。我一般设定在 10 µm，遇到特别脆的组织（比如脑组织）会调到 12 µm。
| 组织类型 | 推荐厚度 (µm) | 刀片角度 (°) | 注意事项 |
|---|---|---|---|
| 小鼠脑 | 10 | 5-8 | 海马区易皱，放慢切片速度 |
| 肝脏 | 8-10 | 4-6 | 脂肪多，防卷板要调紧 |
| 肿瘤组织 | 10-12 | 6-10 | 纤维化区域容易跳片 |
| 皮肤 | 12 | 3-5 | 角质层硬，刀片要新 |
切片机刀片角度大家容易忽略。我见过有人用 15° 的刀角切脑组织，结果每片都皱成一团。标准做法是先用刀片角度规校准到 5-8°，然后试切两片看看有没有划痕或者压缩条纹。
3.3 切片漂片与展片
切下来的组织薄片卷在刀片上，要用镊子轻轻夹住边缘，放进水浴槽里展片。水浴温度很关键——我习惯设在 40 °C，不能超过 45 °C，否则 RNA 会降解。展片时间控制在 10-20 秒，看着组织完全摊平就立刻捞起来。
千万别这样：我曾经图快，把刚切下来的切片直接往 Visium 玻片上贴，结果皱褶把捕获区域遮掉了一半。一定要先用水浴展片，让组织自然舒展，再转移到玻片上。记住：宁可多花 20 秒展片，也不要重新包埋一块组织。
捞片用的玻片有两种：普通载玻片（用来检查切片质量）和 Visium 专用玻片（正式实验用）。我先用普通玻片捞一片，在显微镜下看——细胞形态是否完整，有没有刀痕或皱褶。确认没问题了，再用同一把刀连续切几片，把它们用 Visium 玻片依次捞起。
3.4 放置在 Visium 玻片
这是整个流程里最容易出纰漏的一步。Visium 玻片上有 4 个捕获区域（或者 2 个，看版本），每个区域有 5000 个捕获位点。切片必须完美覆盖捕获区域，而且不能有任何气泡夹在组织与玻片之间。
我的操作步骤是这样的：
- 用镊子把展好的切片从水浴中捞起，放在 Visium 玻片的右上角位置（靠近捕获区域边缘）。
- 用针头轻轻挑起切片一端，让切片缓缓从一侧到另一侧落在捕获区域上。
- 立刻用 10 µL 移液器吸掉玻片上多余的液体，顺便用枪头轻轻把气泡往边缘赶。
- 在体视显微镜下检查气泡情况——如果有气泡，用针头从气泡下方刺一下，让液体进去把气泡排掉。
关键检查清单：
- 切片边缘不超出捕获区域边界（超出部分会浪费探针）
- 组织与玻片之间无可见气泡
- 切片表面平整，无折叠或重叠
- 组织形态完整，无撕裂
3.5 组织固定与染色准备
切片放好之后，要马上用甲醇固定。为什么要快？因为 RNA 在室温下、液体环境中降解很快。我一般从水浴捞片到甲醇固定，控制在 30 秒内完成。
固定步骤很简单：把 Visium 玻片浸入 -20 °C 甲醇中孵育 30 分钟。然后拿出来在室温下风干 5 分钟。之后就可以做 H&E 染色或者免疫荧光了。这里我强调一点：固定后的玻片可以放在 -80 °C 短期保存（一周以内），但别超过一个月，否则 RNA 信号会明显下降。
# 固定步骤速记命令（用计时器）
1. 切片放置完毕 → 立即
2. 浸入 -20 °C 甲醇 → 30 min
3. 室温风干 → 5 min
4. H&E 染色或 -80 °C 冻存嗯，到这里组织切片与放置的关键流程就捋完了。你可能会觉得步骤多，但多做几次就会养成肌肉记忆。我一开始也手忙脚乱，后来把每个步骤的计时器都设好，桌面只放必需的工具——镊子、针头、计时器、水浴槽、甲醇缸——其它东西全收走，减少干扰。实验就是这样，细节决定了数据质量的底线。