空间转录组概述
第一次接触空间转录组，是在三年前的一个肿瘤项目里。当时我们需要搞清楚肿瘤边缘的免疫细胞到底是怎么分布的——光靠单细胞数据，你只能知道有哪些细胞类型，但它们在组织里挨着谁、离血管多远，完全两眼一抹黑。空间转录组就是为了回答这类“在哪里”的问题而生的。
简单来说，空间转录组技术在组织切片上测量每个位置的基因表达量，同时保留空间坐标。你拿到的数据，既像一张高清地图（组织形态），又像一张全转录组热力图（每个点的基因表达）。这与单细胞转录组有本质区别：单细胞数据把细胞打散，丢掉位置信息；空间数据则把每个捕获点的表达量锚定在物理位置上。
技术原理
市面上主流的技术平台，捕获原理大致分两类。
- 基于探针捕获：组织切片贴在带有空间条形码的探针阵列上，透化后mRNA扩散到探针上被捕获。10x Visium、Slide-seq属于这类。
- 基于原位成像：通过荧光标记的原位测序或单分子FISH直接对组织中的RNA进行成像和定量。MERFISH、seqFISH+走这条路。
我个人习惯把整个流程拆成四个环节：
- 切片准备：冰冻或FFPE组织切片，厚度5-10 μm，贴在专用玻片上。
- 透化与捕获：透化时间非常关键——太短RNA出不来，太长信噪比下降。我见过有人透化时间设错，结果整个切片只有背景信号。
- 反转录与文库构建：空间条形码在反转录时被整合到cDNA中，建库后测序。
- 数据拆垛与配准：根据条形码将读段映射回组织上的空间位置，再与H&E图像对齐。
常见平台一览
目前最常用的三个平台，我汇总在下面这张表里。你日常处理的数据大概率来自其中之一。
| 平台 | 捕获原理 | 空间分辨率 | 通量（基因数） | 典型数据规模 |
|---|---|---|---|---|
| 10x Visium | 探针捕获（poly-T或全转录组探针） | 55 μm（每点覆盖1-10个细胞） | ~20000 基因 | 每张切片约5000个点 |
| Slide-seq | 探针捕获（微珠阵列） | 10 μm（近单细胞） | ~15000 基因 | 每张玻片约50000个微珠 |
| MERFISH | 原位成像（多重FISH） | 亚细胞级（~200 nm） | ~200-10000 基因（取决于编码方案） | 视视野大小，可达百万级细胞 |
每个平台都有自己的脾气。10x Visium数据最“规整”，点阵结构固定，生信工具链最成熟。Slide-seq分辨率高但数据更稀疏，我遇到过的一个坑是微珠的局部密度不均匀，导致某些区域的捕获效率异常低。MERFISH虽然分辨率最猛，但基因数有限，而且实验成本高——选它之前想清楚你到底需要多少基因。
与单细胞转录组的本质差异
拿单细胞数据的质控逻辑直接套到空间数据上，会出大问题。因为空间数据里每个捕获点不一定只包含一个细胞——Visium的点直径55 μm，典型包含几个到几十个细胞；而每个点的mRNA含量也远低于单细胞里的单个细胞。我在这上面栽过跟头，后来总结出几个关键差异：
- UMI计数分布不同：空间数据每个点的UMI通常比单细胞的UMI少1-2个数量级。用单细胞的阈值（比如500 UMI/细胞）来过滤空间点，会把大量真实信号点当作空点扔掉。
- 空点识别需要组织形态先验：单细胞靠液体背景就够了，空间数据里你得结合H&E图像判断哪些位置是组织，哪些是背景。
- 批次效应更复杂：空间实验的批次效应不仅来自测序，还来自切片厚度、透化时间、组织固定方式等物理变量。我在一个六个月的大项目里，就因为切片批次间冻存条件不同，导致前三个批次的信号强度整体偏低。
一张图看懂整体知识框架
我把本章涉及的概念画成下面这张图。方便你对照着看：左侧是技术分类，中间是代表性平台，右侧是最终数据输出形式。箭头表示技术路线之间的关系。
你可以把这张图当作本章的导航地图。后面每一章都会围绕图中某个节点展开：透化时间怎么调、空点怎么筛、批次效应怎么度量。从这张图出发，心里就有数了。