1. FASTQ 格式介绍：结构、质量分数编码与常见变体

聊FASTQ格式，我得先说说它的结构。这玩意儿说白了就是测序仪吐出来的原始数据格式，我们做质控的每一步都得跟它打交道。

1.1 四行结构

我刚开始做生信那会儿，一直搞混FASTA和FASTQ。后来被老同事一句话点醒：FASTA有两行，FASTQ有四行。多出来的那两行，刚好就是质量信息。

每条read在FASTQ中固定占用四行：

1. 标识行（以 @ 开头） —— 包含测序仪器、流动槽位置、坐标等信息
2. 碱基序列行 —— A/T/C/G/N 组成的核苷酸序列
3. 分隔行（以 + 开头） —— 通常只写一个 +，也可能重复标识信息
4. 质量值行 —— 与碱基序列等长的ASCII字符，每个字符对应一个碱基的质量分数

你想想看，如果没有第四行，我们就只能知道测出了什么碱基，却不知道这个碱基可不可靠。这就像拿到一份实验报告，只有数据没有误差范围，谁敢信？

@EAS139:136:FC706VJ:2:2104:15343:197393 1:Y:18:ATCACG
CTCAAGGTTGTTGCAAGACGGGAGGTGGTGTAGCTGTATTCAGCTGCGCAC
+
>>>>>ABABBBABBAABBAABBBBBAABBBAB>ABBBAABBBBBAABBBBB

这里要注意第四行和第一行的长度必须完全一致。空一个碱基都不行，多了也不行。我曾经在项目中遇到过测序仪软件bug，第四行比第二行短了几个字符，结果下游比对工具直接崩溃。嗯，这个问题排查了整整两天才找到原因。

行序	行首字符	内容说明	长度约束
第1行	@	仪器标识 + 坐标 + 索引	可变
第2行	无	碱基序列	固定长度（读长）
第3行	+	分隔符，可附带标识	最少1个字符
第4行	无	质量序列（ASCII字符）	与第2行等长

1.2 质量分数编码方式

质量值这行，很多人误以为它是乱码。其实它是按一定规则编码后的数字。我刚刚入行时，看到第四行的">>>>>ABABBBAB..."也是一脸懵，还以为数据坏了呢。

每个ASCII字符对应一个Phred质量分数，公式是这样的：

Q = -10 × log₁₀(P)

其中：
  Q    = Phred质量分数
  P    = 碱基识别错误的概率

举个例子：如果某个碱基的Q值是30，表示错误概率P=0.001，也就是该碱基每1000次测序中可能错1次。准确率则是99.9%。

但注意，质量分数存进FASTQ时，不能直接存数字20、30、40。得把数字映射成ASCII字符。映射方式有两种，这也是新手最容易犯错的地方：

• Phred+33（Sanger格式）：目前主流标准。质量分数 + 33 后转成ASCII字符。Q=0对应ASCII 33（即字符'!'），Q=30对应ASCII 63（字符'?'）。
• Phred+64（Illumina 1.3/1.5格式）：早期Illumina仪器用的。质量分数 + 64。Q=0对应ASCII 64（字符'@'），Q=30对应ASCII 94（字符'^'）。

我看过太多人把Phred+64的FASTQ当Phred+33去解析，结果算出的质量值全部多出31分。这会导致本该过滤掉的低质量数据被放行，后续组装、比对的质量直接崩盘。

1.3 常见FASTQ变体

FASTQ变体，说白了就是不同版本和不同厂商搞出来的小差异。主要有这几种：

1.3.1 根据质量编码区分

根据Sanger/Cock会议达成的社区标准，目前主流变体有：

变体名称	质量编码范围	对应ASCII	常见来源
Sanger	0 ~ 93	33 ~ 126	Illumina 1.8+、Sanger测序、PacBio
Solexa/Illumina 1.0	-5 ~ 62	59 ~ 126	早期Solexa仪器（现已不多见）
Illumina 1.3	0 ~ 62	64 ~ 126	Illumina Genome Analyzer II
Illumina 1.5	3 ~ 62	67 ~ 126	Illumina 1.5 pipeline产物
Illumina 1.8+	0 ~ 41	33 ~ 74	最新Illumina仪器，即Sanger格式

你在实际项目中，如果碰到2015年以前的公共数据（比如NCBI SRA里那些老数据），很大概率是Phred+64。现在的仪器基本统一到Phred+33了。但我说的是基本，不是100%。

1.3.2 根据序列格式区分

除了质量编码，FASTQ还能按读段类型分类：

1. 单端（Single-end，SE）：每个测序片段只从一个方向读一次，文件里一条read只出现一次。
2. 双端（Paired-end，PE）：同一个片段的两端都测，产生两个文件（R1和R2）。同一个read的R1和R2通过标识行中的read编号关联。我个人习惯在做质控时把R1和R2分开跑QC，因为通常R2的质量比R1差一些。
3. 索引（Indexed）：在标识行中增加样本索引序列，用于多路复用（multiplexing）。索引有时单独记录在FASTQ标识行末尾。

1.3.3 压缩变体

FASTQ文件体积巨大。一条人类全基因组测序的FASTQ大概几十GB。所以大多数情况下你会看到这样的压缩后缀：

• .fastq 或 .fq —— 纯文本
• .fastq.gz 或 .fq.gz —— gzip压缩，最常见
• .fastq.bz2 —— bzip2压缩，压缩率更高但解压慢
• .fastq.lz4 —— LZ4压缩，解压速度快，适合管道处理

我一般只用.gz，因为几乎所有质控工具（fastp、Trimmomatic、fastQC）都原生支持gzip文件。你想想看，要是下个数据还得手动先解压再跑QC，那得多浪费时间。

1.4 本章知识体系

下面这张图是我整理FASTQ质控知识体系时的思路框架，把FASTQ格式的核心结构、质量编码和常见变体串在了一起。你拿着这个图去读任何FASTQ文件，都不容易跑偏。