第4章：ComBat的假设条件——什么时候适用
ComBat不是万能的，这我一开始就踩过坑。
你拿一组数据，跑完ComBat一看，嗯，批次效应没了，但生物学差异也快没了。这时候你才意识到——它背后藏着几个硬性假设，数据不符合，结果就失真。
说白了，ComBat是一个线性位置-尺度模型。它假设批次效应是可加的，而且每个批次内的样本独立同分布。你以为它做的是神奇校正常数，其实它做的是均值平移和方差缩放。
4.1 核心假设一：每个批次内样本独立且同分布
这是最基础的一条。ComBat会假设同一批次内的样本，来自相同的分布——均值相同，方差相同。
但现实数据呢？很多时候batch内部本身就有异质性。比如一个测序批次里混了不同组织类型的样本，那分布必然不同。你强行用ComBat，它会强行把所有样本往一个均值上拉，结果就是——真正的高表达被压下去，低表达被抬起来。这不是校正，是扭曲。
如何检查？ 我常用的手段是看每个batch内样本的表达量密度图。如果同一个batch的密度曲线形状差异很大，那就不适合直接用ComBat。或者更简单——跑一个PCA，按batch染色，如果batch内样本在PC1上还分散得很开，那你就要警惕了。
4.2 核心假设二：批次效应是位置+尺度的可加模型
ComBat的模型是这样的：
Y_{ijg} = α_g + Xβ_g + γ_{ig} + δ_{ig} ε_{ijg}这里的 \(\gamma\) 是位置参数（均值偏移），\(\delta\) 是尺度参数（方差缩放）。
这个模型假设批次效应只影响均值和方差的线性部分。如果你碰到的是非线性批次效应——比如批次A的低表达基因普遍被压了一个比例因子，而高表达基因不受影响——那ComBat就无能为力了。
4.3 核心假设三：批次和生物学条件正交
这才是ComBat使用中最容易被忽略的陷阱。
ComBat回归时会做一个设计矩阵，把批次和生物学变量分开拟合。但如果你设计了两个batch分别对应不同的实验条件——比如batch1全是control，batch2全是treatment——那批次和生物学效应就完全混淆了。
这时候ComBat会怎么做？它会把treatment效应的一部分当作批次效应给“校正”掉。你的差异分析结果直接废掉。
| 情形 | 批次与条件 | ComBat有效性 | 建议 |
|---|---|---|---|
| 理想 | 每个批次包含多个条件 | ✔ 有效 | 直接使用 |
| 部分重叠 | 某个批次缺失某个条件 | ⚠ 可能有效 | 谨慎使用，检查残差 |
| 完全混淆 | batch1只有条件A，batch2只有条件B | ✘ 无效 | 不要用ComBat，改用其他方法 |
这个表是我自己总结的。你如果项目数据里batch和condition完全一一对应，那我就直接告诉你——别跑了，跑完也是错的。
4.4 核心假设四：基因数量足够大（大样本渐近）
ComBat的贝叶斯框架里，它要用所有基因的方差信息去“借用强度”，来估计每个基因的\(\delta\)参数。如果基因数量太少（比如<100个），这张借的牌就不够打。
为什么会这样？ 因为每批次内的方差估计需要足够多的数据点来做贝叶斯收缩——基因少了，收缩没有意义，方差估计反而会恶化。
你想想看：如果你的数据只有50个基因，那ComBat的稳定性会很差。我建议至少500个基因以上再用ComBat。如果是蛋白质组学数据，只有200个蛋白，那我会选择limma的 removeBatchEffect 代替ComBat。
4.5 核心假设五：设计矩阵满秩（可逆）
这是一个数学细节，但很致命。ComBat在拟合\(\gamma_{ig}\)和\(\delta_{ig}\)的时候要计算最小二乘解，如果设计矩阵奇异（秩亏），那正则方程就解不出来。程序会报错，或者更糟——悄悄给你一个错误结果。
我建议跑ComBat前，先做一个诊断：
# 假设你有batch和condition两个变量的设计矩阵
design_matrix <- model.matrix(~ batch + condition)
qr(design_matrix)$rank == ncol(design_matrix)如果结果是 FALSE，那就说明有问题。你要么合并某些level，要么删除冗余列。
4.6 一张图看懂ComBat的假设生态
4.7 实战检查清单
每当我拿到一个新数据集，我通常按下面几步检查：
- 分布检查：每个batch内样本的箱线图和密度曲线是否一致。
- 方差齐性检验：Levene检验判断batch间方差是否成比例。
- 混淆检查：做一张批次×条件的列联表，确认没有完全混淆。
- 基因数量检查：确认基因数 > 500；若 < 500，考虑不跑贝叶斯版本。
- 共线性诊断：用QR分解检查设计矩阵的秩是否等于列数。
避坑指南：我曾经接手过一个同事的半成品，他的数据只有200个基因，batch和condition完全一一对应，还强行跑了ComBat。结果差异分析P值全部被抹平。我后面花了三天重写分析流程，改用limma批次作为随机效应才挽救回来。你记住这句话：数据不满足假设，ComBat就是一把劣质的刀，切什么都没准头。
4.8 什么时候可以放心用ComBat？
简单总结一下：
- 数据批次内同质，生物学结构清晰
- 批次效应主要是均值偏移+方差缩放
- 每个批次都包含多个生物学条件（正交）
- 基因数量充裕（千级或万级）
- 设计矩阵没有冗余参数
满足这五点，你就可以放心用ComBat了。有一条不满足，我建议你先想办法解决——比如合并批次、增加基因、重新设计实验——再跑校正。