测序平台与深度测量方法

测序深度这个指标，跟测序平台的选择是绑死的。不同平台出来的数据，计算深度的方式完全不同。我在项目里见过不少新手，拿着Illumina的数据直接套Nanopore的计算公式，结果导致后续分析全盘出错。

这一章我们就把主流平台的核心参数讲透，再教你怎么准确计算深度。

主流测序平台及其核心参数

目前实验室里常用的平台其实就三类。我们来看它们的核心差异：

平台类型	典型代表	读长范围	单次数据产出	主要应用
短读长平台	Illumina NovaSeq / HiSeq	150 ~ 300 bp	600 Gb ~ 3 Tb	全基因组、外显子、RNA-seq
长读长平台	PacBio Sequel / Revio	10 ~ 25 kb	80 ~ 360 Gb	结构变异、基因组组装
超长读长平台	Oxford Nanopore PromethION	10 kb ~ 2 Mb+	50 ~ 250 Gb	重复区域、甲基化检测

讲三点我自己的观察：

• Illumina的数据量优势很明显，但读长短，对重复区域无能为力。我之前做全基因组测序，目标深度30×，如果只算唯一比对的reads，实际有效深度可能只有20×。
• PacBio的HiFi模式（CCS read）读长通常在15kb左右，准确度能到Q30以上。我建议做变异检测时优先选HiFi数据。
• Nanopore的优势是超长读长，但单碱基准确度不太好（最开始只有85%~90%）。现在最新的R10.4芯片加Q20+试剂，准确度已经能到Q30了。不过我还是习惯做一下consensus校正。

深度到底怎么算？

先说定义。测序深度（Depth）就是覆盖某个位点的独立read数量。但实际操作中，有几种不同的深度概念：

1. 物理深度 （Physical Depth）：文库中不同DNA片段覆盖某位点的总数。这个值跟你打断片段的方式有关。
2. 有效深度 （Effective Depth）：经过质控和比对后，真正用于变异检测的reads覆盖数。去重和不合格比对后往往会损失10%~20%。
3. 覆盖度 （Coverage）：深度≥1×的基因组比例。它是评估数据完整性的关键指标。

如何计算深度：从理论到命令行

最简单的公式：
测序深度 = （总碱基数 × 平均读长） / 基因组大小

举个例子，人类基因组约3.1 Gb，你想做到30×深度，需要产出总碱基数：3.1 Gb × 30 = 93 Gb。换算成150 bp双端reads，就是93 Gb / 150 bp ≈ 6.2亿条reads。

我在项目中一般直接用samtools depth来算。给你看一段常用命令：

# 计算每个位点的深度
samtools depth -a sample.bam > sample_depth.txt

# 统计平均深度
cat sample_depth.txt | awk '{sum+=$3; count++} END {print "平均深度: " sum/count}'

# 计算深度覆盖比例（比如深度≥10×的区域占比）
cat sample_depth.txt | awk '{if ($3 >= 10) covered++} END {print "10×覆盖比例: " covered/NR*100 "%"}'

嗯，这里要注意：-a参数会输出所有位点，包括深度为0的位置。如果不加-a，samtools depth只输出有比对信息的位点，那样计算出的平均深度会虚高。

分析实战：BAM文件深度分布

只看平均深度是不够的。我会更关注深度分布情况。举个例子：

# 统计深度区间分布
samtools depth -a sample.bam | awk '
{
    if ($3 == 0) zero++;
    else if ($3 < 5) lt5++;
    else if ($3 < 10) lt10++;
    else if ($3 < 20) lt20++;
    else if ($3 < 30) lt30++;
    else if ($3 < 50) lt50++;
    else gt50++;
}
END {
    print "深度=0位点比例: " zero/NR*100 "%"
    print "深度1-5×比例: " lt5/NR*100 "%"
    print "深度5-10×比例: " lt10/NR*100 "%"
    print "深度10-20×比例: " lt20/NR*100 "%"
    print "深度20-30×比例: " lt30/NR*100 "%"
    print "深度30-50×比例: " lt50/NR*100 "%"
    print "深度>50×比例: " gt50/NR*100 "%"
}'

为什么会需要看分布？举个真实案例。我之前做一个肝癌WGS项目，平均深度32×，看起来很好。但一看深度分布图，发现外显子区域深度只有8×，而内含子区域被严重扩增。最后发现是PCR过度扩增导致的偏差。

平台选择与深度的映射关系

不同应用场景，对深度的要求差别很大。我整理了一个参考表：

分析类型	推荐平台	建议物理深度	备注
全基因组SNP检测	Illumina	30-50×	需要有效深度≥20×
稀有变异检测	Illumina	60-100×	低频变异需要更高深度
结构变异检测	PacBio / Nanopore	15-30×	长读长优势明显
RNA-seq表达定量	Illumina	20-30M reads	非深度，而是read总数
甲基化检测	Nanopore	30-50×	需要足够覆盖才行

深度测量的核心流程

我们把这章的重点画成一张图，方便你快速对照实操：

最后总结一句话：不要迷信平均深度，要看有效深度和深度分布。 我在项目中吃过这个亏，希望你别再踩一遍。实际操作时，先跑一遍上面的命令，看清楚数据质量，再做后续分析决策。