4、数据加载与QC：把原始数据变成干净的单细胞对象
终于到了动手的环节。单细胞分析的第一步，就是把测序仪输出的原始数据，塞进Seurat对象里。这一步做不好，后面所有分析都会歪。我见过太多人跳过QC直接跑聚类，结果画出来的UMAP图全是垃圾……说白了，数据加载和质控才是整个流程里最值得花时间的步骤。
4.1 读取10X Genomics标准输出
10X Genomics的数据，最常见的是Cell Ranger管道输出的三个文件：
barcodes.tsv.gz
features.tsv.gz
matrix.mtx.gzSeurat提供了专用函数 Read10X()，一行搞定：
library(Seurat)
# 假设数据在 "filtered_feature_bc_matrix/" 目录下
counts <- Read10X(data.dir = "filtered_feature_bc_matrix/")
# 创建Seurat对象
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = counts, project = "PBMC_4k")你想想看，为什么用 filtered_feature_bc_matrix 而不是 raw？因为Cell Ranger已经帮你把空液滴和死细胞过滤了一次。但别完全信任它，二次QC还是必须的。
gene.column = 2。
4.2 读取其他格式的数据
不是所有数据都来自10X。H5格式、CSV、甚至h5ad（Scanpy输出）我都遇到过。这里给几个常用方法：
| 数据格式 | 推荐方法 | 说明 |
|---|---|---|
| 10X H5（单个文件） | Read10X_h5() |
直接读取filtered_feature_bc_matrix.h5 |
| CSV/TSV 矩阵 | ReadMtx() |
需要barcodes和features文件 |
| H5AD（Scanpy输出） | ReadH5AD() |
需安装hdf5r包，常用于跨平台合作 |
| 10X v2/multiome | CreateSeuratObject() + 手动拼接 |
有时features文件列名不一致，需调试 |
举个例子，读取一个商业平台输出的CSV文件：
expr_matrix <- read.csv("counts.csv", row.names = 1)
obj <- CreateSeuratObject(counts = expr_matrix, project = "custom_data")dim() 和 head() 检查原始矩阵。
4.3 计算QC指标：线粒体、基因数、UMI数
Seurat对象创建后，会自动计算两个基本指标：nCount_RNA（每个细胞的UMI总数）和 nFeature_RNA（每个细胞检测到的基因数）。但我们一般再加一个：线粒体基因比例。为什么？细胞破裂或凋亡时，线粒体RNA会因为没有核膜保护而大量释放，导致比例异常高。
计算线粒体比例的方法：
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")注意，人类用 ^MT-，小鼠用 ^mt-。如果你在用斑马鱼或其他物种，得先看一眼线粒体基因的前缀。
我觉得这一步最容易出问题的是：版本差异。老版本Seurat里 PercentageFeatureSet 第二个参数叫 features，新版本改成了 pattern。如果你查旧代码直接复制，可能会报错。
三个核心指标我们要重点看：
- nCount_RNA：UMI总数。太低说明细胞捕获失败或空液滴；太高可能是双细胞或技术异常。
- nFeature_RNA：检测到的基因数。同样，太低是死细胞/空液滴，太高可能双细胞。
- percent.mt：线粒体比例。一般死细胞超过10-20%就要警惕。
怎么观察？画小提琴图：
VlnPlot(pbmc, features = c("nCount_RNA", "nFeature_RNA", "percent.mt"))一般来说，一眼就能看出异常尾巴。我习惯把三个图叠加在一起，先看整体分布，再定阈值。
4.4 质控过滤：设定阈值
阈值没有绝对标准，取决于组织类型和实验条件。这里给一份我在PBMC数据集上常用的参数做参考：
| 指标 | 典型阈值 | 逻辑 |
|---|---|---|
| nFeature_RNA | 200 ~ 2500 | 低于200可能是空滴或死细胞，高于2500可能是双细胞 |
| nCount_RNA | 不设上限，但结合基因数看 | 如果UMI很高但基因数很少，说明技术噪声 |
| percent.mt | < 20%（严格时< 10%） | 超过20%基本是垂死的细胞 |
过滤代码：
pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & percent.mt < 20)实际项目中，我还会额外检查doublet得分（用DoubletFinder等工具），但那是后面的内容了。对于基础QC，上述过滤就够了。
4.5 本章知识框架图
为了让你一眼看清整个流程，我画了一张SVG图：从原始数据到干净对象的每一站。
整个流程并不复杂，但每一步的决策都会影响最终结果。我自己的经验是：先快速画一个粗略的QC图，选好阈值后再做一次精细过滤。别一次性把参数定死，灵活调整才能适应不同数据。