第二章：批次效应与数据标准化基础

2.1 批次效应：它到底是什么？

做单细胞整合，第一个绕不开的坎就是批次效应。

说白了，就是你同一种细胞，在不同时间、不同试剂或不同操作人员手里测出来的数据，差异比不同细胞类型还大。这不是生物差异，这是技术噪声。

我早年做过一个免疫细胞项目，CD8+ T细胞在两个批次里，一个表达像NK细胞，另一个像浆细胞，吓我一跳。后来发现是建库试剂盒批号不同搞的鬼。

2.2 批次效应的典型特征

• 技术假象：同一细胞类型跨批次分离，不按生物学聚类
• 非对称分布：有的批次整体偏移，有的只局部扭曲
• 放大难题：小样本的批次效应比大样本更明显

2.3 产生批次效应的主因

2.4 如何快速发现批次效应

你不是肉眼去看原始矩阵的，那没法看。常用的方法是降维可视化：

• PCA 分布图：如果每个batch各自抱团，就有问题
• t-SNE 或 UMAP：初看分离，说明批次效应明显

我一般直接扫一眼PCA的前两个组分，假如batch标签能完美分开，那就得认真考虑校正了。比如这样：

import scanpy as sc
adata = sc.read("your_data.h5ad")
sc.pp.pca(adata)
sc.pl.pca(adata, color="batch")

看到的结果如果是几个点团按batch颜色全部分开——嗯，批次效应很严重。

2.5 数据标准化基础知识

你想想看，不做标准化的原始counts数据，差异动辄上千倍，直接塞进BBKNN算法里，它根本分不清是生物学差异还是技术噪声。

2.5.1 为什么要标准化

• 消除测序深度差异
• 稳定方差：高表达基因不要过度支配距离度量
• 使数据接近正态/可比较

2.5.2 标准化“三件套”

1. Counts per million (CPM)：最简单，每个细胞除以总counts再乘以百万
2. Log转换：通常是log1p（log(x+1)），降低动态范围
3. Scaling/Z-score：每个基因减去均值再除标准差

做BBKNN时，我个人的常用流程是：CPM -> log1p。有时候对数据分布不满意，再扫一眼标准化后的方差是否稳定。

2.5.3 高变基因选择：标准化到位的关键

数据标准化处理后，不能直接用全部基因。大部分基因是不动的。我们会挑出方差最大的前2000个基因（highly variable genes, HVG）。

BBKNN的KNN图就是在这些高变基因上构建的，而不是全基因组。

sc.pp.highly_variable_genes(adata, n_top_genes=2000, flavor='seurat_v3')
adata = adata[:, adata.var.highly_variable]

我习惯把HVG数设为2000-3000。太少了会丢掉稀有细胞群，太多了又会引入技术噪声。

2.6 标准化的实战流程

来看一个我常用的标准化步骤，会把它跟BBKNN的前置结合起来：

# 1. 原始counts：好习惯，总是保留一份raw数据
adata.raw = adata

# 2. 标准化：先cpM再log
sc.pp.normalize_total(adata, target_sum=1e4)
sc.pp.log1p(adata)

# 3. 高变基因选择
sc.pp.highly_variable_genes(adata, n_top_genes=2000)
adata = adata[:, adata.var.highly_variable]

# 4. 再次缩放建议（可选但推荐）
sc.pp.scale(adata, max_value=10)

2.7 知识结构图：批次效应与标准化

我画了一张图，能帮你理清这一章的知识骨架。注意看这些步骤间的依赖关系，不能跳着来。