第1章 VCF文件格式基础
做多批次VCF一致性评估，最先要面对的就是VCF文件。
我第一次接触VCF时，打开文件一看，满屏的#号和TAB分隔符，说实话有点懵。后来啃了很久的官方规范，又在实际项目里摔了几次跟头，才算真正搞明白。
这一章，我就带你仔细看看VCF到底长什么样。
VCF是什么？
VCF全称Variant Call Format，是GA4GH（Global Alliance for Genomics and Health）制定的变异数据标准。说白了，它就是为了统一记录基因组上的变异信息而存在的。无论你是做WGS全基因组测序，还是做WES全外显子组测序，最后产出的变异结果基本都是VCF格式。
VCF文件的核心结构可以用三个层级来理解。
- 元数据层：以##开头的注释行，记录文件版本、参考基因组、数据来源和过滤条件
- 表头层：以#CHROM为起始的最后一行注释，告诉你怎么解读后面的数据列
- 数据层：Tab分隔的变异记录行，每行代表一个变异位点
嗯，这里要注意。很多人误以为VCF就只是变异信息的罗列，其实元数据部分包含了很多评估一致性的关键信息，比如工具版本、参数配置等。我曾遇到过一个项目，两个批次文件看起来差不多，但Filter列的含义完全不同。原因就在元数据里的Filter定义不一致。
VCF文件结构全貌
下面我手绘了一张结构图，你一看就明白。
元数据：解读VCF的第一把钥匙
元数据行以##开头，包含文件的所有配置信息。我个人习惯，拿到任何VCF文件，第一件事就是看元数据头。
以下是几种最常见的元数据类型。
| 元数据标签 | 含义 | 示例 |
|---|---|---|
##fileformat |
VCF规范的版本号 | ##fileformat=VCFv4.2 |
##reference |
参考基因组文件路径或版本 | ##reference=file:///ref/GRCh38.fa |
##INFO |
INFO字段中各标签的定义 | ##INFO=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Total depth"> |
##FORMAT |
FORMAT字段中各标签的定义 | ##FORMAT=<ID=GT,Number=1,Type=String,Description="Genotype"> |
##FILTER |
过滤条件定义 | ##FILTER=<ID=q10,Description="Quality below 10"> |
##ALT |
替代等位基因的定义（如结构变异） | ##ALT=<ID=DEL,Description="Deletion"> |
##INFO和##FORMAT的定义必须对齐。有一次我发现两个批次的DP含义不一样——一个表示总深度，一个表示平均深度，直接导致下游分析出现偏差。
表头行：数据列的含义总纲
表头行是元数据部分的最后一行，以#CHROM开头。它不是##，而是单#。这一行告诉你每一列分别代表什么。
固定列一共9列，顺序严格固定。
| 列名 | 说明 |
|---|---|
| CHROM | 染色体编号，如chr1、chrX |
| POS | 位点坐标，1-based整数 |
| ID | dbSNP rsID或自定义标识，没有用.表示 |
| REF | 参考基因组上的碱基序列 |
| ALT | 变异后的碱基序列，多个用逗号分隔 |
| QUAL | 质量值，越高越可信 |
| FILTER | 过滤状态，PASS表示通过 |
| INFO | 冒号分隔或分号分隔的键值对 |
| FORMAT | 样本数据字段格式定义 |
第10列之后是样本列，数量不定。FORMAT定义了如何解读这些样本列。你想啊，如果FORMAT写的是GT:AD:DP，那样本列里就是三个值，用冒号隔开，依次对应GT、AD和DP。
关键字段详解
关键字段里，我最想聊的是以下这几个。评估一致性时，它们经常出问题。
1. CHROM和POS：定位位点身份
这两个字段共同决定了变异的位置。不同批次的VCF，染色体命名可能不同。有的用chr1，有的只用1。我建议在评估前统一标准化chr前缀，否则同样的位点可能会被判定为不同位置。
2. REF和ALT：描述变异内容
REF是参考等位基因，ALT是替代等位基因。注意，对于SNP来说REF=A ALT=G就一行。但对于Indel，REF和ALT长度不同。举个例子：REF=ACGT ALT=A表示删除了一个CGT。
REF=ACGT ALT=A表示删除，B批次用REF=CGT ALT=A表示同一个变异，但因为参考等位基因不完整导致没匹配上。这类问题在合并VCF时经常发生，稍不注意就会遗漏位点。
3. QUAL和FILTER：质量评估过滤器
QUAL是浮点数，值越高表示可信度越高。FILTER则是一个条件标签，PASS是唯一表示通过的标签。其他如q10、LowQual都被认为是没有通过的。
多批次评估时，我建议那些通过了QUAL而FILTER不是PASS的位点，直接剔除，因为它们可能因为各种原因被标记为了不靠谱的变异。
4. INFO：变异级别的注释
INFO字段包含变异级别的额外信息，比如等位基因频率AF、测序深度DP、等位基因支持数AC等。这些值在不同批次之间可能存在差异，但要注意数值类型是否一致。
5. FORMAT和样本数据：转录组级别与基因型
FORMAT定义了样本数据的格式，最常见的标签是GT（基因型）、AD（等位基因深度）、DP（样本深度）。
基因型GT的编码规则是这样的。
| GT编码 | 含义 |
|---|---|
| 0/0 | 纯合参考 |
| 0/1 | 杂合变异 |
| 1/1 | 纯合变异 |
| ./. | 缺失（无有效基因型） |
##fileformat版本是否一致？##reference指向的参考基因组版本是否相同？- CHROM的命名风格是否统一？
- FILTER中PASS的定义是否相同？
- FORMAT字段是否一致？
一个完整的VCF示例
下面是一个实际的VCF文件片段，你可以对照着体会一下。
##fileformat=VCFv4.2
##reference=GRCh38
##INFO=
##INFO=
##FILTER=
##FILTER=
##FORMAT=
##FORMAT=
#CHROM POS ID REF ALT QUAL FILTER INFO FORMAT sample1
chr1 10010 . A G 50.2 PASS DP=100;AF=0.5 GT:AD 0/1:30,70
chr1 10020 rs123 T C 99.8 PASS DP=200;AF=0.3 GT:AD 1/1:0,200
chr2 50000 . G A 30.1 q10 DP=50;AF=0.1 GT:AD 0/0:50,0
chr3 200000 . ACGT A 80.0 PASS DP=150;AF=0.2 GT:AD 0/1:120,30 你看看第三行，QUAL=30.1，FILTER=q10，虽然质量值不太差，但被过滤掉了。这种位点在一致性评估时，是否要纳入，取决于你的研究目标。如果是要高精度的位点，我建议直接过滤掉。
一致性评估视角下的VCF关键点
从评估一致性的角度出发，我总结了三个必须注意的点。
- 位点对齐性：同一批次的两个VCF，或者不同批次之间的VCF，必须使用相同的坐标系统和参考基因组。否则位点无法直接比较。
- 字段命名一致性：INFO和FORMAT的标签名必须相同。即使内容含义一样，但标签名变了，也无法通过一致性检查。曾经在一个项目中，一个批次用DP表示深度，另一个批次用DP_HQ表示深度，导致了一个错误率的误判。
- 基因型编码规则：GT的编码方式要一致。有些工具使用0|1分隔符表示已定相，有些使用0/1。如果混在一起使用，一致性评估会出错。
VCF文件格式虽然看起来复杂，但只要抓住元数据、表头、数据行这个骨架，再搞清楚INFO、FORMAT、GT这些核心字段，做一致性评估时就能知其然并知其所以然了。说白了，VCF不是什么黑盒，它就是个精心设计的表格文件。