📚 课程目录第1章空间转录组学概述

1. 空间转录组学概述

空间转录组学，说白了就是给基因表达加上"位置信息"。传统的单细胞测序把细胞打散了测，你只知道细胞类型，却不知道它们在组织里是怎么排布的。空间转录组技术就是要弥补这个缺憾——在组织原位检测基因表达，或者通过计算手段还原空间位置。

我刚开始接触这个领域时，说实话挺懵的。各种技术名词，什么Visium、Slide-seq、MERFISH，听起来都很高大上。但用了一段时间后你会发现，它们本质上解决的是同一个问题："这个基因在哪里表达？"只是手段不同而已。

1.1 三大主流技术原理

10x Visium —— 目前市场占有率最高的空间转录组平台。它的核心是把带有空间条形码的探针预先排在玻片上，每个捕获点直径55 μm，相邻点中心间距100 μm。组织切片贴上去后，透化处理让mRNA释放出来，与探针结合，随后反转录成cDNA，建库测序。每个点的条形码已知，测序后你根据条形码就能知道每个read来自哪个空间位置。我去年处理过一个心脏组织的Visium数据，那种看到基因表达与解剖结构完美对应的感觉，确实挺震撼的。

Slide-seq —— 思路完全不同。它把带有条形码的微珠随机铺在玻片上，每个微珠直径约10 μm，比Visium的点小得多。组织切片后mRNA被微珠捕获，但因为微珠位置是随机排列的，需要通过测序前的成像来确定每个微珠的坐标。Slide-seq的优势是分辨率高，但代价是覆盖均匀性不如Visium。我记得有个同事做过对比，Slide-seq在某些基因的检测灵敏度上会打折扣，空间覆盖也不太均匀。选型时你需要权衡一下。

MERFISH —— 属于成像类技术，不依赖测序。它通过多重荧光原位杂交，用连续几轮杂交和成像来检测RNA分子。每一轮杂交都带一个编码信号，通过解码这些信号就能确定每个RNA分子的身份和位置。分辨率是单分子级别，这是它的最大优势。但它需要预选基因，不能像测序类技术那样无偏检测全转录组。我建议如果你有明确的靶向基因列表，MERFISH是个不错的选择。

1.2 主流技术对比与选型

三种技术放在一起看，差异主要在分辨率、通量和实验复杂度上。下面这个表我经常在培训时拿出来讲，方便大家快速决策。

技术	原理	分辨率	转录组覆盖	优势	主要局限
10x Visium	探针捕获 + 空间条形码	55 μm (点)	全转录组	商业化成熟，操作标准化	分辨率较低，无法到单细胞
Slide-seq	微珠捕获 + 成像定位	~10 μm	全转录组	分辨率高，适合精细结构	覆盖均匀性差，实验难度大
MERFISH	多重FISH成像	单分子级别	靶向 / 全转录组	分辨率极高，单细胞精度	需预选基因，通量受限

选型经验： 我个人习惯先看研究问题需要的分辨率。如果做肿瘤微环境这种大尺度分析，10x Visium就够用了；如果要做神经突触或发育生物学，直接上MERFISH或Slide-seq。千万别贪高分辨率选了复杂技术，结果样本处理不过关，数据质量反而不如Visium。

1.3 数据格式与特点

空间转录组的数据格式，不同技术各有各的"脾气"。但核心都一样：一个表达矩阵 + 空间坐标信息。

10x Visium 的标准输出是H5文件和MEX格式（也就是Market Exchange格式）。H5文件里打包了 counts 矩阵、barcode 和 feature 信息，用 Read10X_h5() 可以直接读。MEX格式则是三个文件：barcodes.tsv.gz、features.tsv.gz 和 matrix.mtx.gz。另外还有一个 spatial/ 目录，里面放组织切片图像和坐标映射文件。

# 10x Visium 典型的输出目录结构
sample/
├── filtered_feature_bc_matrix.h5
├── filtered_feature_bc_matrix/
│   ├── barcodes.tsv.gz
│   ├── features.tsv.gz
│   └── matrix.mtx.gz
├── raw_feature_bc_matrix.h5
└── spatial/
    ├── tissue_positions_list.csv
    ├── scalefactors_json.json
    └── image.tif

Slide-seq 的数据格式相对简单，通常是一个大CSV或H5文件，每一行代表一个微珠，包含基因表达计数和微珠的物理坐标。需要注意，Slide-seq的坐标是连续的浮点数，而不是Visium那种离散点阵。

MERFISH 的数据则包含单分子级别的坐标文件，每个RNA分子都有一个(x, y, z)坐标和基因ID。通常以CSV或HDF5格式存储，数据量极大——一个视野可能就有几百万个分子点。

所有空间转录组数据都有三个共性特点，我在实际项目中深有体会：

稀疏性——大部分基因在大部分空间位置检测不到，零表达比例往往超过90%。
空间自相关性——相邻位置的基因表达高度相似，这不是统计噪声，而是组织本身的规律。
多模态——很多技术同时产出基因表达数据和组织学图像（H&E染色或免疫荧光），两种模态需要联合分析。

    经验提醒： 我在处理跨技术数据整合时，发现数据格式的差异是第一个坑。Visium的离散点阵坐标和Slide-seq的连续坐标，在计算空间邻接矩阵时逻辑完全不同。建议统一转换为 AnnData 格式（.h5ad）后再做后续分析，ScanPy 生态对空间数据的支持已经比较成熟了。

1.4 常见批次效应来源

批次效应，说白了就是"非生物学差异"。同一个基因在同样类型的细胞里表达量差不多，但因为技术或操作原因，测出来却不一样。空间转录组的批次效应比单细胞更复杂，因为除了表达量，还涉及空间模式。

我归纳为三大来源：

技术差异 —— 不同技术的原理不同，捕获效率、灵敏度、分辨率都不一样。同一批样本用Visium和Slide-seq测，结果肯定有系统偏差。即使同一技术，不同试剂批次、不同测序深度也会引入差异。我记得有一次，同一样本分两次送测，测序深度差了30%，聚类结果就出现了明显的"批次对"。从那以后，我每次都会记录测序深度和试剂批号。
实验室差异 —— 操作人员的手法和习惯、实验环境（温度、湿度）、组织处理流程（切片厚度、透化时间）都会影响数据质量。透化时间尤其敏感——透化不足mRNA释放不够，透化过度信号扩散导致空间分辨率下降。这个参数几乎每个实验室都得重新优化。
样本差异 —— 组织来源（新鲜 vs. FFPE）、保存方式（速冻 vs. 固定）、处理时间（取组织到切片的时间间隔）都会引入变异。我曾经处理过一批小鼠脑样本，其中几个样本的RNA完整性指数（RIN值）偏低，结果那些样本的数据在降维图上自成一群。

避坑指南： 我曾经在整合两个实验室的Visium数据时，直接合并表达矩阵就跑聚类，结果UMAP图上样本按实验室来源分成两团，生物学差异完全被掩盖了。所以批次校正不是可选项，而是必选项。在这套教程里，我会带着你一步步做完整的批次校正流程。

总结一下，空间转录组的数据分析，第一步不是跑模型，而是搞清楚你手里的数据来自什么技术、什么格式、有没有批次问题。把这三个问题先理清楚，后面的分析才能走得顺。