3. BLAST 变体与工具选择：到底该用哪一个？

好，这是很关键的一讲。我们刚才聊了 BLAST 的基本原理，但你打开 NCBI 的 BLAST 页面，会发现一堆选项：BLASTN、BLASTP、BLASTX、TBLASTN、TBLASTX……再加上一个 blastx 的变体……嗯，有点晕是吧？

别急。实际项目里不是每个工具都要用，选错了轻则跑得慢，重则漏掉关键注释。我今天就把这几个「变体」的适用场景拆开揉碎了讲清楚。每个工具解决什么问题，写什么命令，我在项目里踩过什么坑，一起过一遍。

3.1 BLASTN：核酸 vs 核酸

简单粗暴。你的查询序列是 DNA，数据库也是 DNA。它直接比较碱基序列，速度最快，对同源性的分辨率也最高。特别适合：

• 已知基因在另一个菌株里的等位基因查找
• 16S rRNA 鉴定（物种鉴定经典场景）
• 质粒序列比对，看同源区域

我个人习惯在跑 BLASTN 时把 -word_size 调小一点，默认一般是 11，但如果在做耐药基因筛查（比如找 mecA 的同源变异），我会降到 7，这样能抓到更发散的同源片段。代价是速度下降，不过小基因组无所谓。

常用命令示例：

blastn -query query.fasta -db nt -out results.txt \
       -outfmt 6 -evalue 1e-10 -word_size 11

3.2 BLASTP：蛋白 vs 蛋白

你手上有一段蛋白序列，或者你已将基因翻译成了蛋白质，去比对蛋白质数据库。

做抗生素抗性基因注释时，我几乎首选 BLASTP。为什么？因为蛋白质序列比核酸更保守。核酸序列很容易因同义突变而看上去“差异大”，但蛋白序列能保留核心功能结构域。换句话说，你用 BLASTP 能找到更远缘的同源基因——这在你注释未知病原菌时特别重要。

• 适用于：已有 ORF 预测结果，做功能注释
• 推荐数据库：NR、Swiss-Prot、UniRef
• 参数注意：-evalue 我一般设为 1e-5，再高噪声太多

命令示例：

blastp -query proteins.faa -db nr -out blastp_results.txt \
       -outfmt "6 qseqid sseqid pident length mismatch gapopen qstart qend sstart send evalue bitscore" \
       -num_threads 8 -evalue 1e-5

3.3 BLASTX：核酸 vs 蛋白（我最常用的一个）

你有一段 DNA 或 cDNA，但不知道它里面有没有“隐藏”的编码区。BLASTX 会帮你把输入的核酸序列自动按六种读框翻译成蛋白质，再比对蛋白数据库。

这在病原菌基因组里太常用了：你测序得到一个 contig，有很多片段，你想立刻知道这些片段大概编码什么——不需要等 ORF 预测完成。BLASTX 能做到。

• 典型场景：新基因组初步功能标注、RNA-seq 读段的功能注释
• 优势：能发现新基因、跨物种的远同源关系
• 注意点：速度慢（因为内部要翻译六框架）

我一般做初筛时这么用：

blastx -query contigs.fasta -db nr -out blastx_contigs.txt \
       -outfmt 6 -evalue 1e-3 -num_threads 8

3.4 TBLASTN：蛋白 vs 核酸

和 BLASTX 刚好反过来——你的查询是蛋白质序列，数据库是核酸。工具会把数据库中的每条核酸序列翻译成六框蛋白，然后和你的查询蛋白比对。

这有什么用？比如你有一个已知的抗性蛋白序列，想看看在某个细菌基因组（DNA序列）里有没有编码类似蛋白的区域——即使这些区域没有正式标注为基因，也能找到。

• 适合场景：在未注释的基因组草图中找同源结构域
• 一种“反向”推测：已知蛋白，找其编码基因的可能位置
• 我曾在噬菌体序列注释中用过，效果很好

命令示例：

tblastn -query protein.fasta -db assembled_genome.fasta \
        -out tblastn.out -outfmt 6 -evalue 1e-5

3.5 TBLASTX：核酸 vs 核酸，但蛋白层面

这个最「重型」。查询序列和数据库序列都是核酸，但内部都会翻译成六种读框的蛋白序列，再在蛋白层面比对——相当于你做了两次 BLASTX。

说实话，我个人很少用。只在一种情况下用过：当我比对两条相距较远的基因组（比如不同属的细菌），且怀疑存在极保守的新基因，核酸层面的比对全无结果时，才会尝试 TBLASTX。

它超级慢，而且结果解读需要小心。因为从核酸到蛋白、再到跨读框匹配，假阳性会增加。

tblastx -query unknown.fasta -db reference_genome.fasta \
        -out tblastx.txt -outfmt 6 -evalue 1e-3

3.6 对比一览表

工具	查询类型	数据库类型	核心用途	推荐频率
BLASTN	核酸	核酸	同源基因、标记基因鉴定	高频
BLASTP	蛋白	蛋白	蛋白功能注释	高频
BLASTX	核酸	蛋白	新基因组初步注释、RNA-seq	极高频
TBLASTN	蛋白	核酸	在未注释序列中找同源区	中频
TBLASTX	核酸	核酸	极远缘同源搜索	低频

3.7 一个直观的选择逻辑

我把这个选择逻辑画了一张流程图，方便你贴在工位旁：