1、Visium技术原理简介与数据特点

刚开始接触Visium的时候，我也觉得不就是个空间转录组嘛，跟单细胞差不太多。做了几个项目之后才发现，它背后的探针设计逻辑和组织切片处理，直接决定了你能从数据里挖出什么。这一章我带你走一遍整个流程——从探针怎么设计，到组织切片怎么上芯片，再到你手头那个.h5文件和spatial文件夹里到底放了啥。

1.1 探针设计：捕获mRNA的关键

Visium用的是空间条形码（spatial barcode）技术。每一张捕获玻片上，密密麻麻排着数千个捕获点（spots），每个点的直径55μm，点间距100μm。每个点上面都连着一段DNA探针。这段探针的结构很有意思：

• 最外面：一段通用引物（可以用来建库）
• 中间：一个空间条形码（唯一标识该点位的坐标）
• 再里面：一个UMI（Unique Molecular Identifier），用于去除PCR重复
• 最末端：一段poly(dT)序列，用来捕获带有poly(A)尾巴的mRNA

我有个项目做小鼠脑组织，当时没注意探针的物种兼容性，直接用人的探针去跑——结果信号极低。后来才搞清楚，Visium的探针设计是针对特定物种的mRNA poly(A)尾巴的，虽然不同物种poly(A)尾巴保守，但探针的捕获效率和背景噪音差别很大。

1.2 组织切片与上芯片

组织切片是这个流程里最容易翻车的环节。我自己第一次做的时候，切出来的厚度是15μm，结果组织碎片一堆，渗透效率极差。Visium官方推荐的厚度是10μm，对于大部分组织（脑、肿瘤、肝脏）都适用。太厚了，mRNA渗透不进去；太薄了，组织容易破损。

切片之后，组织被贴到捕获玻片上。注意：不是随便贴。你得在透化（permeabilization）之前，用H&E染色或者免疫荧光给组织拍一张明场图像。这张图后面要做两个事：一是用来给组织区域做手动/自动对齐，二是作为基因表达热图的背景参考。

透化步骤很关键：用蛋白酶把细胞膜打孔，让mRNA释放出来，向下扩散到捕获点上。透化时间如果太短，mRNA出不来；太久，mRNA会扩散到相邻的点，造成空间溢漏（spillover）。我记得有个肿瘤样本，透化时间从12分钟延长到18分钟，结果相邻基因的表达相关性从0.3飙到0.7——明显溢漏了。

1.3 原始数据到底长什么样？

做完测序下来，你拿到的东西大概长这样：

• 一个filtered_feature_bc_matrix.h5或raw_feature_bc_matrix.h5
• 一个spatial文件夹，里面包含tissue_hires_image.png、tissue_positions_list.csv、scalefactors_json.json等文件
• 可能的还有aligned_fiducials.jpg

我习惯把.h5文件理解成一张稀疏矩阵表：行是基因，列是捕获点的条形码（barcode），值是UMI计数。注意，每个捕获点对应一个条形码，而不是像10x单细胞那样一个条形码对应一个细胞。这一点经常有人混淆。

下面这张SVG图帮你理清从组织切片到数据表格的完整流程：

1.4 理解tissue_positions_list.csv和scalefactors_json.json

这两个文件是你把基因表达“贴”回到组织图像上的桥梁。我简单拆解一下：

举个例子：in_tissue是0或1，1表示这个点落在组织区域内。我遇到过一批数据，组织切片没贴好，in_tissue有80%是0，结果有效点只有200个——这种样本基本没法做下游聚类。

# tissue_positions_list.csv 示例（前3行）
AAACCCAAGAAACACA-1,1,39,12,86.2,115.8,86.2,115.8
AAACCCAAGAAACAGG-1,1,39,13,86.2,116.8,86.2,116.8
AAACCCAAGAAACTAC-1,0,39,14,86.2,117.8,86.2,117.8

// scalefactors_json.json 示例
{
    "tissue_hires_scalef": 0.170,
    "spot_diameter_fullres": 89.32,
    "fiducial_diameter_fullres": 106.0,
    "tissue_lowres_scalef": 0.042
}

1.5 数据特点影响后续分析策略

明白了原始数据的结构，你就能预见到几个重要特点：

• 稀疏性：每个捕获点覆盖多个细胞（大约1~10个细胞，取决于组织类型），所以表达矩阵比单细胞更稀疏，基因检出率低。我习惯用过滤标准：保留至少在10个点中有表达的基因，并且每个点至少检测到100个UMI。
• 空间自相关：相邻捕获点的表达模式相似，这是空间聚类的基础。但也是假阳性空间信号的来源——比如透化时间过长导致的溢漏。
• 批次效应：不同切片、不同芯片、不同测序批次之间，技术差异很明显。我有个项目让同一个实验室做了两批，结果UMI中位数差了3倍，必须在聚类前用harmony或scVI做批次校正。

嗯，这一章就到这里。你心里大概对Visium的“物理”部分和数据源头有个概念了。下一部分我们真正动手，把原始.h5数据读进Python环境，开始做质量控制和归一化。