1. Visium技术简介：空间转录组学背景、10x Visium平台原理、实验流程概述
1.1 我们为什么需要空间转录组学？
传统转录组学，比如 bulk RNA-seq 或单细胞 RNA-seq，说白了就是把组织打碎了去测。你拿到一个基因表达矩阵，知道每个细胞或每团细胞里各种基因的丰度，但不知道这些细胞原来在组织里待在哪。这就好比你知道一群人的简历，但不知道他们在会议室里怎么坐的。
我最早做肿瘤免疫课题时，常碰到这种情况：一个基因在bulk数据里显著高表达，可到底是肿瘤细胞、基质细胞还是浸润的T细胞在表达？单细胞测序能解决细胞类型的问题，但它把空间位置信息丢了。你想想，肿瘤细胞和免疫细胞是挨在一起还是隔得很远，这直接决定免疫治疗能不能起效。
空间转录组学就是来补这个缺的。它给每个基因表达量，在原位保留了一张空间坐标图。这样你就可以问——“在肿瘤前沿区域，有没有一群免疫细胞正在高表达PD-1？”这种问题单靠传统方法根本回答不了。
3 10x Visium平台到底做了什么？
10x Visium 是目前最主流的基于捕获探针的空间转录组平台。它不是原位杂交，也不是原位测序，而是一种很巧妙的“空间条形码”技术。
Visium 玻片上预先排布了成千上万个捕获点（spots），每个点直径 55 μm，相邻两个点中心间距 100 μm。每个点上固载着一堆寡核苷酸探针，这些探针的 5' 端锚定在玻片上，3' 端带有：
- Poly(dT) 序列 — 用来捕获 mRNA 的 poly(A) 尾。
- UMI（唯一分子标识符） — 每个 mRNA 分子一个，用于去除 PCR 重复。
- 空间条形码（Spatial Barcode） — 这是核心。每个 spot 都有唯一的一段碱基序列，相当于它的“经纬度 ID”。
- 接头序列 — 用于后续文库构建和测序。
实验时你把新鲜冰冻组织切片贴在玻片上，经过 H&E 染色拍照，再透化处理释放 mRNA。这些 mRNA 会扩散到下方邻近的捕获点，被 poly(dT) 钓住。然后你在玻片上进行反转录，cDNA 就带上了这个 spot 的空间条形码。之后把 cDNA 洗脱下来，建库、测序，最终得到一张“基因 × spot”的表达矩阵，每个 spot 对应 H&E 图像中的一个位置。
我个人第一次拿到 Visium 数据时，盯着那个空间分辨率的图看了半天——你能直接把基因表达热图叠回 HE 染色上，那种视觉冲击力很强。你会清楚看到所谓的“肿瘤边界”到底长什么样。
1.3 实验流程速览：从组织到数据
Visium 的全套实验流程，大致可以分成 7 步。我把它拉个表，方便你概览。
| 步骤 | 操作 | 产出物 |
|---|---|---|
| 1. 组织制备 | 新鲜冰冻组织，OCT 包埋，经冷冻切片机切为 10 μm 薄片，贴在 Visium 玻片捕获区域内。 | 组织切片 |
| 2. H&E 染色 & 成像 | 对切片做标准的 H&E 染色，然后用明场显微镜拍下整张图像。这张照片后续用来对齐 spots。 | 组织学图像 |
| 3. 透化 | 用蛋白酶处理组织，释放 mRNA。这一步需要预先优化时间，以保证捕获量且不扩散过度。 | 释放的 mRNA |
| 4. 反转录 | 在玻片上进行原位反转录。每个 mRNA 分子被打上它所在 spot 的空间条形码和 UMI。 | 带条形码的 cDNA |
| 5. 文库构建 | 将 cDNA 从玻片上洗脱下来，进行 PCR 扩增、片段选择，加上 P5/P7 接头和样本索引，建成测序文库。 | 测序文库 |
| 6. 测序 | 通常用 Illumina NovaSeq 6000 或 NextSeq 2000 进行双端测序。推荐每个样本测 5 ~ 10 万 reads / spot。 | FASTQ 文件 |
| 7. 数据预处理 | 使用 Space Ranger（10x 官方工具）对 FASTQ 进行拆分、比对、UMI 计数，生成表达矩阵和 Spot × 图像对齐文件。 | filtered_feature_bc_matrix.h5 |
嗯，这里要注意：第 3 步和第 4 步在同一个玻片上完成，中间不能移动切片。我曾看到有人把透化后的玻片拿下去洗，结果 spots 里的捕获探针被冲走了，整个实验报废。记住——一旦组织贴上去，所有后续操作都在玻片上进行，没有“转移”这一步。
1.4 理解空间条形码：为什么一个 spot 不是一个细胞？
有一个概念新人特别容易搞混：每个 spot 直径 55 μm。而大多数哺乳动物细胞直径在 10 ~ 20 μm。所以一个 spot 下覆盖的可能是 1 ~ 10 个细胞，甚至更多，取决于组织密度。
Visium 不是单细胞分辨率。它是“近邻细胞分辨率”。这意味着我们拿到的每个 spot 的基因表达谱是它下面所有细胞的总和。那为什么还要用它？
- 因为它通量大，一次实验就是一张组织切片，覆盖数千个 spots，整个组织区域。
- 因为成本可控，建库、测序的费用远比单细胞 + 空间多模态来得低。
- 因为绝大多数课题在“区域”尺度上就能回答——比如肿瘤区域 vs 基质区域，炎症区域 vs 正常区域。
1.5 本章知识体系总览
下面这张图是我自己梳理的 Visium 核心技术逻辑，从组织切片到数据产出，所有关键节点都标出来了。我建议你把这幅图当作后续学习的路线图。