📚 课程目录第1章 Visium技术简介与数据特征

Visium技术简介与数据特征归纳总结

空间转录组学这几年火得不行。说白了，它能告诉我们基因在哪表达，而不仅仅是表达多少。我个人最早接触Visium技术，是2019年底的一个脑肿瘤项目。那时候拿到的数据又新又杂，组织切片质量也参差不齐。今天我想把Visium这套技术的基本概念和数据特征捋清楚。

Visium是10x Genomics公司的拳头产品。它的核心思路很简单——把组织切片放在一张带有空间条形码（Spatial Barcode）的捕获阵列上，然后做转录组测序。每个捕获点（spot）直径55微米，中心间距100微米。嗯，这意味着每个spot会捕捉到1到10个细胞的总mRNA信号。你想想看，这分辨率其实很粗糙，但足以区分组织区域。

技术参数	指标	说明
捕获点直径	55 μm	每个spot的物理尺寸
捕获点间距	100 μm	相邻spot中心距离
每点捕获细胞数	1–10 个	取决于细胞密度和尺寸
捕获阵列面积	6.5 × 6.5 mm²	标准捕获区域
基因检测灵敏度	中等	低于scRNA-seq，但保留空间位置

关键认识：Visium不是单细胞分辨率的技术。它是一个"区域级"的空间转录组工具。很多初学者期望它能像scRNA-seq那样分辨每个细胞，这是不现实的。我在一个肿瘤免疫项目中吃过这个亏，后来用反卷积（deconvolution）才把细胞类型信息拆出来。

数据产出的三大件

Visium实验做完之后，你会拿到三样东西。每一件都不能少。

空间坐标（Spatial Coordinates）：每个spot在组织切片上的X、Y坐标。这些坐标是绝对的物理位置，单位是微米。数据格式通常是CSV或JSON。
基因表达矩阵（Gene Expression Matrix）：标准的UMI计数矩阵，行是基因，列是spot。和单细胞数据的格式几乎一样。
组织图像（H&E Image）：高分辨率的H&E染色全片扫描图像。这是你做空间对齐和区域标注的视觉基础。

这三者通过spot ID一一对应。你想想看，如果没有图像，坐标就是一堆数字；如果没有坐标，基因表达和普通bulk数据没有区别。三者缺一不可。

数据特征：痛点与机会

Visium数据有一些非常鲜明的特性。我总结为四点。

1. 高稀疏度

每个spot覆盖了几个细胞，但检测到的基因数量远低于scRNA-seq。一个spot通常只有1000–3000个基因，UMI深度在5000–20000之间。你可以对比一下，10x的单细胞数据每个细胞能检测到3000–5000个基因。为什么Visium这么少？因为RNA捕获效率受到组织渗透和空间条形码密度的限制。记得有一次我看到一个spot只有800个基因，我一度以为实验失败了。后来发现，那是组织边缘的细胞碎片区，生物学上就是低表达的。

2. 空间自相关性

相邻的spot更像。这是空间转录组数据最核心的统计特性。一个spot和它周围6个（六边形排列）或4个（方形排列）邻居在表达谱上有明显的相似性。嗯，这个特性是所有空间聚类算法能工作的依据。你不利用空间自相关性，直接拿scRNA-seq的聚类方法来跑，效果会很差——我以前就这么干过，聚类结果一片混乱，后来老老实实加了空间权重。

3. 批次效应

Visium的批次效应比单细胞数据轻一些，但依然存在。不同切片、不同跑序（run）、不同组织批次之间都会产生技术性差异。如果你做多切片整合，必须做批次矫正。我个人习惯用Harmony + 空间正则化，效果比单纯用Seurat的Integration更稳定。

4. 图像信息可用

这是Visium独有的优势。H&E图像提供了组织形态学信息。你可以用它做组织区域划分，或者检查spot是否落在组织碎片、气泡上。我曾经在图像上发现一批spot落在了脂肪组织的气泡区域，表达量极低，直接过滤掉——如果你只看基因数据，这些spot会混在分析里拖后腿。

注意：不要把图像信息和基因数据混在一起做归一化。它们是不同模态的数据。图像用于质控和辅助区域标注，基因数据用于聚类和差异表达分析。我曾经见过有人把RGB值直接当特征输入聚类模型，结果聚类出来的区域全是染色强度分区，和生物学完全不相关。

数据预处理流程概览

我一般走下面这个流程。你可以根据项目情况微调。

# 标准预处理步骤（简要流程）
1. 原始测序数据（FASTQ） -> Space Ranger 比对定量
   - 生成feature-barcode矩阵（HDF5 + MEX格式）
   - 生成tissue_positions_list.csv（spot坐标 + 是否在组织内）
   - 生成scalefactors_json.json（图像缩放因子）

2. 质控（QC）：
   - 过滤低质量spot：检测总UMI < 1000 或 基因数 < 500
   - 过滤异常spot：线粒体基因比例 > 20%
   - 图像质控：排除落在组织气泡、清洗液残留区域的spot

3. 标准化：
   - 采用SCTransform（推荐）或LogNormalize
   - 保留细胞周期效应？空间数据不需要，但需要保留组织区域差异

4. 降维：
   - PCA降维到30–50个主成分
   - 如果用空间算法，保留更多主成分（50–100）

5. 可视化：
   - 将低维特征映射回组织图像坐标
   - 生成空间特征图（Spatial Feature Plot）

建议：拿到新数据后，先做一张总UMI的空间分布图。如果高UMI区域和图像上的组织区域对不上，说明对齐出了问题。我每次都会第一时间生成这张图，能省掉后面很多调试时间。

下面这张图概括了Visium数据从组织切片到聚类分析的核心数据流。我把它叫作"Visium三体结构"——基因表达、空间坐标、组织图像三者交汇产生分析结果。

Visium数据的这些基本特征决定了后续聚类策略的选择。空间数据不是普通的单细胞数据，也不是普通的图像数据。它有自己的脾气。我见过太多人拿标准的Louvain聚类直接往空间数据上跑，结果一团糟。嗯，后面的章节我会逐步拆解不同聚类算法的适应场景和坑。

一句话总结：理解数据特征，选择算法才有依据。Visium技术的核心优势在于空间上下文，挑战在于低分辨率和稀疏性。把这些摸透了，后面的聚类对比学习才能真的学进去。