4. 参考基因组准备

做多组学转换，最绕不开的一步就是准备参考基因组。很多人觉得这活儿简单——去 UCSC 或者 Ensembl 拖个文件下来不就行了？嗯，真这么做，八成后面跑 STAR 或 bowtie2 时会踩坑。我个人习惯是把参考基因组和索引当成项目的基础设施来对待，一次搭好，反复用。

4.1 参考基因组下载——选对来源是第一步

我见过有人从网盘里随便下个 FASTA，结果染色体命名跟 GTF 对不上，跑完比对才发现问题，白白浪费三天。所以，务必从权威渠道获取：

• Ensembl：物种全、版本清晰，每季度更新一次。我用的是 Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa。
• NCBI RefSeq：命名更保守，适合要求严格的场景。
• UCSC：常用 hg38，但下载时注意它是 2bit 格式，要转成 FASTA。

这里有个避坑指南：我记得有一回项目里需要把 FASTQ 从 hg19 升级到 GRCh38，Ensembl 的染色体名字前面带 chr，而 NCBI 不带。如果混用，下游比对工具会直接报错。所以我后来写了个小脚本做统一检查。

4.2 构建比对索引——STAR / BWA / bowtie2 各有脾气

索引文件说白了就是把参考基因组建成一种快速检索的结构。不同比对工具要的索引不一样，不能混用。下面我按工具一个一个讲。

4.2.1 STAR 索引——RNA-seq 场景首选

STAR 对内存要求高，但速度快。我一般用 Ensembl 的 FASTA + GTF 一起建索引，一步到位。

# 下载 FASTA 和 GTF（以人类 GRCh38 为例）
wget ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-112/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz
wget ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-112/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.112.gtf.gz
gunzip *.gz

# 建 STAR 索引
STAR --runThreadN 8 \
     --runMode genomeGenerate \
     --genomeDir ./star_index \
     --genomeFastaFiles Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
     --sjdbGTFfile Homo_sapiens.GRCh38.112.gtf \
     --sjdbOverhang 149

参数说明：--sjdbOverhang 一般设为读长减 1。我的读长是 150 bp，就用 149。如果你读长不固定，保守点设 149 也没大问题。

4.2.2 BWA 索引——DNA比对 / 变异检测

BWA 适合 DNA 序列比对，尤其是全基因组或外显子组。它有三种算法：mem（主流）、aln（较老）、sw（少用）。我只用 BWA-MEM。

# 下载参考基因组（同 STAR 用的 FASTA 即可）
# 建 BWA 索引
bwa index -p hg38_bwa Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa

执行完后会生成 .amb、.ann、.bwt、.pac、.sa 五个文件。我一般用 -p 指定前缀名，方便在命令里直接引用。

4.2.3 Bowtie2 索引——小基因组或非编码RNA

Bowtie2 比 BWA 更擅长比对短序列，比如 miRNA 或细菌基因组。它的索引命令类似：

bowtie2-build --threads 8 \
              Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
              hg38_bowtie2

这里注意：Bowtie2 生成的 .bt2 索引文件与 BWA 不通用。我踩过一次坑——用 BWA 的索引传给 Bowtie2，直接报错退出。

4.3 GTF 注释文件——不只是基因位置清单

GTF 文件记录了基因、转录本、外显子等结构信息。你想想看，没有它，STAR 怎么知道哪个区域是内含子、哪个是外显子？测序数据转换到 H5AD 时，基因表达定量全依赖 GTF 里的 gene_id 和 gene_name 映射。

4.3.1 下载 GTF 的最佳实践

• Ensembl：与 FASTA 版本号必须一致。比如 GRCh38 release 112，就用对应的 GTF。
• GENCODE：质量更高，注释更完整，推荐用于人类和小鼠。格式也是 GTF。
• RefSeq：从 NCBI 下载，对于临床项目比较好。

我个人倾向用 GENCODE。它的 gene_type 字段标注得很细（protein_coding、lncRNA、pseudogene 等），后期过滤时很方便。

4.3.2 版本同步——最容易被忽视

为什么说版本同步很重要？有一回我帮同事排查问题：他下载的是 GRCh38.p13 的 FASTA，却用了 GENCODE v40 的 GTF。结果比对时 STAR 报了很多 warning，说 splice junction 与注释不匹配。查半天才发现 FASTA 和 GTF 的参考基因组版本差了好几个补丁。

# ref/human/GRCh38/ensembl/README.txt
# Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa
# 来源: Ensembl release 112
# 下载日期: 2025-01-15
# md5sum: a1b2c3d4e5f6...
#
# Homo_sapiens.GRCh38.112.gtf
# 来源: Ensembl release 112
# 下载日期: 2025-01-15
# md5sum: 9f8e7d6c5b4a...

4.4 知识结构图：参考基因组准备流程

4.5 避坑清单——我踩过的五个坑