📚 课程目录第2章单细胞数据读取与创建Seurat对象

单细胞数据读取与创建 Seurat 对象：从原始文件到可分析的数据结构

拿到单细胞数据的第一件事是什么？不是跑分析，是先把数据读进来。我见过不少同学，把10X的matrix.mtx当作普通文本直接读，结果搞了一整天……嗯，这活确实能手动做，但Seurat给你封装好了，咱们就好好用。

这章的核心就两件事：不同平台的数据怎么读，以及CreateSeuratObject的参数怎么调。说白了，就是把外部的原始数据变成Seurat能理解的"对象"，后面所有分析都基于这个对象展开。

2.1 数据格式千差万别，读取方法也得跟着变

单细胞测序平台五花八门，输出格式自然不统一。我最早做项目时，实验室既有10X又有Smart-seq2，每次换数据集都得翻文档……后来总结出一个规律：先看文件扩展名，再选读取函数。

平台	典型文件结构	推荐的读取方法
10X Genomics (v2/v3)	`matrix.mtx.gz`, `barcodes.tsv.gz`, `features.tsv.gz` 或 `raw_feature_bc_matrix.h5`	`Read10X()` 或 `Read10X_h5()`
10X Multiome (RNA + ATAC)	多组学H5文件，包含多个assay	`Read10X_Multiome()`
Drop-seq	数字表达矩阵 (DGE) 或 `*.dge.txt.gz`	`ReadDGE()` 或 `read.table()`
Smart-seq2	每个细胞一个文件，或整合后的表达矩阵	`ReadSmartSeq()` 或直接读矩阵
H5AD / Loom	单文件HDF5格式 (常见于Scanpy生态)	`ReadH5AD()` 或 `ReadLoom()` 然后 `as.Seurat()`

2.1.1 10X数据——最流行，也最不容易出错

如果你做的是10X数据，恭喜你，Seurat为它提供了最完善的"一站式"读取方案。我个人习惯优先用H5版本，因为一个文件搞定所有，不容易漏文件。但有些实验室给的是MEX格式（三个文件），也没问题。

# 读取H5文件（推荐）
library(Seurat)
counts_h5 <- Read10X_h5("raw_feature_bc_matrix.h5")

# 读取MEX格式（三个文件在同一个目录下）
counts_mex <- Read10X(data.dir = "filtered_feature_bc_matrix/")

# 多组学数据（如10X Multiome）
counts_multi <- Read10X_Multiome(data.dir = "filtered_feature_bc_matrix/")
# 返回一个list，包含"Gene Expression"和"Peaks"两个矩阵

注意区分：Read10X() 默认找 matrix.mtx，如果文件夹下有多个子目录（如 raw_feature_bc_matrix），记得把路径指向正确的子目录。我曾经因为路径写错了一层，卡了半小时……

2.1.2 Drop-seq与Smart-seq2——矩阵在手，天下我有

这两个平台的数据，本质都是一张基因 × 细胞的计数矩阵。区别在于Drop-seq通常提供稀疏矩阵格式（DGE），而Smart-seq2更常见的是稠密矩阵（行是基因，列是细胞，值可能是FPKM或TPM，但建议用原始计数）。

# Drop-seq DGE格式
dge <- ReadDGE("sample.dge.txt.gz")
# 返回的是稀疏矩阵，可以直接传给CreateSeuratObject

# Smart-seq2——直接用read.table读
expr_matrix <- read.table("expression_matrix.tsv", header = TRUE, row.names = 1, sep = "\t")
# 如果值是TPM或FPKM，最好做转换？别急，后面我们会讲标准化，但CreateSeuratObject只认整数计数
# 对于非UMI数据，保留原始值即可，但最好注明是"log-normalized"还是"raw counts"

一个经验：Smart-seq2数据经常有大量dropout（零值），读进来后记得用FeatureScatter检查一下基因表达分布。如果发现很多基因只在1~2个细胞中表达，后面min.cells参数得调大一些。

2.2 CreateSeuratObject——把原始数据"包装"成标准对象

数据读进来了，现在我们要调用CreateSeuratObject()函数。这个函数就像一台打包机——你把原始计数矩阵塞进去，它吐出一个含有assay、meta.data、reductions等空壳的Seurat对象。注意，这时候对象里还没有降维、聚类，只有原始表达矩阵和最基本的质量控制信息。

函数签名长这样（我挑最常用的参数讲）：

CreateSeuratObject(
  counts,          # 原始计数矩阵（稀疏/稠密均可）
  project = "SeuratProject",  # 项目名称，用于标识
  assay = "RNA",   # 测序类型，默认为RNA
  names.field = 1, # 从细胞barcode中提取分组信息
  names.delim = "_", # 分隔符
  meta.data = NULL, # 额外的细胞元数据
  min.cells = 3,   # 至少在多少细胞中表达的基因才保留
  min.features = 200 # 一个细胞至少要有多少基因表达
)

我见过太多人直接带着默认参数跑了。这样行不行？也行，但结果往往不够干净。咱们逐个拆解一下关键参数。

2.2.1 counts——唯一必须手动传的参数

原始计数矩阵，必须是整数。Seurat内部会把它存储为稀疏矩阵（dgCMatrix），所以即使你传的是稠密矩阵，它也会帮你转换，节省内存。

2.2.2 min.cells 和 min.features——第一道质控门

这两个参数是创建对象时就执行的过滤，而且过滤速度非常快（因为只做计数筛选）。

min.cells = 3：基因至少在3个细胞中出现，才保留。这能去掉那些"幽灵基因"——比如只在1个细胞中意外捕获的噪声。
min.features = 200：每个细胞至少检测到200个基因。如果低于这个数，大概率是空液滴或死细胞。

你可能会问：那后续不是还有更细致的质控吗？对，这里只是粗略过滤，但能极大减小对象大小。我做过的一个PBMC数据集，原始矩阵含3万个基因，设了min.cells = 3后只剩1.8万，节省了40%内存。

我曾经踩过的坑：有一批Smart-seq2数据，部分细胞的测序深度很低，min.features设成200后，丢了一半细胞。后来我把阈值降到100，先建对象，再在质控阶段用subset()结合其他指标（如线粒体比例）做精细过滤。所以阈值不要一刀切，结合你的实验设计来定。

2.2.3 project——给对象打标签

这个参数默认是"SeuratProject"。如果你有多个样本，建议改成有意义的名字，比如"PBMC_healthy_1"。后面合并对象时，project字段会作为默认的样本标识，省得你自己再去加。

pbmc <- CreateSeuratObject(counts = counts_h5,
                            project = "PBMC_Control_DonorA",
                            assay = "RNA",
                            min.cells = 3,
                            min.features = 200)

一个小技巧：如果数据来自不同批次，可以在meta.data中预置批次信息，比如：

meta <- data.frame(row.names = colnames(counts), batch = rep("batch1", ncol(counts)))
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = counts, meta.data = meta)

这样后面做整合时，就不用手动添加了。

2.2.4 names.field 和 names.delim——解析细胞barcode里的"密码"

某些10X数据，细胞barcode可能长这样：AAACCCAAGAAACTCA-1。如果names.delim = "-"且names.field = 1，Seurat会把"-"后面的数字（1）提取出来，存到meta.data的orig.ident列中。如果你每个样本都单独跑10X管道，这个数字就是样本索引。不过我个人习惯在project里直接指定，所以一般保持默认不额外设置。

2.3 创建完对象后，先检查什么？

用上面代码创建好对象后，别急着做下一步。先简单看看：

# 打印对象信息
pbmc
# 输出类似：
# An object of class Seurat 
# 2000 features across 1000 samples within 1 assay 
# Active assay: RNA (2000 features, 0 variable features)

# 查看前6个细胞的barcode和细胞数
head(colnames(pbmc))
# 查看meta.data中的列
head(pbmc@meta.data)

注意看nCount_RNA和nFeature_RNA这两列——它们是创建对象时自动计算的，分别表示每个细胞的UMI总数和检测到的基因数。如果发现有细胞nFeature_RNA为0，那可能是空液滴或者数据读取有问题，需要排查原始数据。

2.4 特殊场景：多模态数据（CITE-seq / ASAP-seq）

如果你的数据同时包含RNA和蛋白质（CITE-seq），或者RNA和ATAC，你可以在创建对象时指定多个assay。但Seurat官方推荐的做法是：先用RNA数据创建一个标准对象，再用CreateAssayObject()添加其他模态。这部分我会在第5章详细讲，这里先提一句。

还记得我一开始说的吗？单细胞分析的起点就是把东西读进来。现在你有了一个干净、标准、可复现的Seurat对象。接下来所有分析——质控、标准化、降维、聚类、注释——都跑在这个对象上。踩稳这一步，后面的路会顺很多。