第4章 Seurat基本分析流程回顾：标准化、降维、聚类、marker基因识别
说实话，很多刚接触Monocle的朋友，上来就盯着拟时序轨迹图看。结果数据跑出来，轨迹歪七扭八，自己也搞不清哪里出了问题。我告诉你，八成是前面的Seurat基础流程没走稳。
标准化、降维、聚类、找marker——这四步看着像常规操作，但每一步的选择都会直接影响后续的拟时序推断。今天咱们把这四个环节拆开，讲清楚「为什么这么做」和「做了会怎样」。
4.1 标准化：先把数据拉到同一把尺子上
原始的单细胞表达矩阵，说白了就是一堆计数。不同细胞的文库大小不一样，基因长度也不同。直接比较肯定不行。
Seurat默认用的是 LogNormalize。它的逻辑很简单：每个细胞的UMI数除以该细胞的总UMI，再乘以一个缩放因子（默认10000），然后取自然对数。
# Seurat标准化
pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)嗯，这里我要提一句。我在做早期项目时，碰到过一种情况：某种细胞类型本身RNA含量就低，标准化后信号被压得特别平。结果聚类时死活分不出来。后来换了 SCTransform，效果才明显改善。
| 标准化方法 | 适用场景 | 缺点 |
|---|---|---|
| LogNormalize | 常规数据，快速稳定 | 对低表达基因不敏感 |
| SCTransform | 需要保留更多生物学变异 | 大样本计算较慢 |
| CLR (Centered Log-Ratio) | CITE-seq蛋白数据 | 对稀疏矩阵不太友好 |
4.2 降维：从两万维到几十维
标准化之后，我们有两万多个基因的表达量。但你想想看，直接拿这两万多维数据去做聚类，计算量惊人，而且噪声也大。
降维的套路，业内基本是两步走：先用PCA做线性降维，再用UMAP/tSNE做可视化。
# PCA降维
pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc))
# UMAP可视化
pbmc <- RunUMAP(pbmc, dims = 1:10)这里有个坑，我踩过——主成分数量选多少？ 有人直接写1:30，有人用ElbowPlot看一眼。我个人习惯是：先跑个30个PC，看看拐点在哪儿。一般10~20个就够了。选太多，噪声跟着进来；选太少，稀有细胞群可能被淹掉。
n.neighbors 默认15，你最好调成30~50。为什么呢？后面讲轨迹推断时会细说。
4.3 聚类：把细胞归堆
降维之后，轮到聚类上场。Seurat用的是基于图的聚类——说白了，就是先根据PCA空间里的距离，给每个细胞找几个邻居，然后构建一个图，最后用Louvain或Leiden算法切分社区。
# 聚类
pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:10)
pbmc <- FindClusters(pbmc, resolution = 0.5)分辨率 resolution 是个调味剂。默认0.5会出来个大概轮廓。你要是想看到更细的子群，比如某种T细胞亚型，就调到0.8甚至1.2。
我记得有一次，为了分出一个罕见的浆细胞亚群，我逐步把分辨率从0.5拉到1.5，才算勉强拆开。但代价是其他群也被切得太碎。这时候怎么办？后续用marker验证，再决定是否合并。
4.4 标记基因识别：给每个集群贴个标签
聚类分好了，但每个群里是什么细胞？你得看marker基因。
# 找所有群的marker
all.markers <- FindAllMarkers(pbmc, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25)这里我习惯加 only.pos = TRUE——只看上调的基因，下调的往往不是核心特征。还有 min.pct 和 logfc.threshold 这两把过滤器，太低会筛出一堆假阳性，太高又可能错过真正的标记。
举个例子，T细胞的CD3D、NK细胞的GNLY、B细胞的MS4A1。如果某个群同时高表达CD14和FCGR3A，那八成是单核细胞。嗯，这些知识图谱你得自己熟悉。
一张图看懂Seurat四步流程
下面这个图，把上面说的四步串起来。你自己对照着看，每个环节的输出是什么，下一步的输入又是什么。
我其实想表达一个意思：Seurat这四步不是孤立的技术操作，而是一套完整的数据理解流程。标准化管数据的可比性，降维管特征提取，聚类管分组逻辑，marker管生物学身份。缺一个，后面的拟时序轨迹就是空中楼阁。