实验设计：项目背景、样本信息与测序策略
做生信项目，最怕什么？
我个人觉得，不是跑不动流程，也不是 bug 调不出来。而是数据都跑完了，才发现实验设计有硬伤。样本搞错了，测序深度不够，或者批次效应大到没法校正。那时候你想补救，基本来不及。所以这一章，咱们先聊聊实验设计。说白了，就是“怎么打仗”的问题。
我这次讲课用的是一个真实项目。我们当时给一个跨国药企做罕见病的关联研究。样本来自三个国家，测序平台也不一样。嗯，这里要注意，联合分型最怕的就是数据来源太杂。如果不提前规划好，后面 GVCF 合并时会出各种幺蛾子。
1.1 项目背景
项目的目标是检测某个罕见遗传病的致病位点。这个病发病率很低，大概万分之一。所以我们需要大样本量，才能抓到足够多的携带者。
项目设计如下：
- 疾病类型：家族性高胆固醇血症相关位点
- 入组标准：临床确诊患者 + 一级亲属
- 对照来源：公共数据库（1000 Genomes、gnomAD）
- 样本总量：500 例（200 患者 + 300 亲属/对照）
- 测序平台：Illumina NovaSeq 6000
- 测序策略：WGS，30× 平均深度
关键点：联合分型最适合“家系 + 对照”这种设计。因为 HaplotypeCaller 在做群体分型时，能利用家系内部的连锁信息，提高低频变异的检出率。
我曾在另一个项目中遇到过相反的情况。当时样本全是散发病例，没有家系结构。结果联合分型跑完后，很多低频位点被过滤掉了。后来我们改成了单样本独立分型 + 群体合并，效果反而更好。所以说，实验设计一定要跟着数据结构走。
1.2 样本信息
样本信息这块，我建议你也做成结构化的表格。不要用 Excel 里随便填的文本，后面解析起来很痛苦。
我们这次用的样本清单如下：
| 样本ID | 家系ID | 关系 | 性别 | 表型 | 测序批次 |
|---|---|---|---|---|---|
| FH001 | FAM01 | 先证者 | 男 | 患者 | B01 |
| FH002 | FAM01 | 父亲 | 男 | 未患病 | B01 |
| FH003 | FAM01 | 母亲 | 女 | 未患病 | B01 |
| FH004 | FAM02 | 先证者 | 女 | 患者 | B02 |
| FH005 | FAM02 | 母亲 | 女 | 携带者 | B02 |
| … | … | … | … | … | … |
我的习惯：我会在样本清单里额外加两列——BAM路径 和 GVCF路径。这样后面写脚本批量处理时，直接从表格读取就行，不用手动拼接路径。
你想想看，如果项目里有 500 个样本，每个都要手动输入路径，那得错多少？
1.3 测序策略
测序策略决定了你的数据质量上限。说白了，就是“你花了多少钱，就得到什么级别的数据”。
我们这次用的是 WGS，30×。为什么选这个？
- WGS vs WES：WGS 覆盖更均匀，尤其是内含子和调控区。对于罕见病，很多致病位点可能不在外显子区域。WES 会漏掉。
- 30× vs 15×：30× 的深度能保证杂合位点的检出率 > 95%。15× 对于低频变异就不太够用了。
避坑指南：我曾经在一个项目中采用了 10× WGS 数据做联合分型。结果跑完后，低频位点（MAF < 0.01）的 call rate 只有 60% 左右。后来重新测到 30×，才达到 90% 以上。所以，如果你要做低频/罕见变异分析，深度千万别省。
具体的测序参数如下：
| 参数 | 值 |
|---|---|
| 平台 | Illumina NovaSeq 6000 |
| 模式 | PE150 |
| 平均深度 | 30× |
| Q30 比例 | > 85% |
| 比对率（bwa-mem） | > 99% |
| PCR 重复率 | < 5% |
嗯，这里还要注意一个细节：测序批次。我们项目分了三批上机。批次之间可能存在偏差，比如某些区域的覆盖度不一致。联合分型时，需要把批次信息作为协变量加进去，不然会引入假阳性。
1.4 本章知识结构
下面这张图，概括了实验设计的核心逻辑。从项目背景到样本信息，再到测序策略，每一步都会影响后面的分析。
1.5 小结
实验设计的原则，我总结成三句话：
- 明确目标：你要找什么变异？低频还是罕见？这决定样本量和深度。
- 结构化数据：样本信息、测序参数、批次信息，全部做成表格。别用散文件。
- 提前跑 QC：拿到 BAM 后，先检查深度、比对率、重复率。发现问题早点重测，别等联合分型跑完才发现。
我建议你，在正式开始联合分型之前，先做一个小测试：用 5 个样本跑一轮完整的流程，看看数据质量有没有问题。我当时就是靠这个步骤，发现了一批样本的 GC 偏差，及时做了校正。