📚 课程目录第2章基因组学基础与突变图谱

2. 基因组学基础与突变图谱

各位好，欢迎来到第二章。上回我们聊了多组学的大框架，今天得把地基夯实——基因组学。

说白了，你要是连DNA上那些突变都看不懂，后面甲基化、转录组、蛋白组就没法串联。我个人的经验是，突变图谱是一切多组学整合的锚点。没有这个锚，你后面所有关联分析都是在空中楼阁。

2.1 DNA测序技术演进——从Sanger到长读长

你想想看，我们怎么知道一个人的基因组序列？靠测序。

技术演进大致分三个阶段：

技术世代	代表平台	读长	通量	主要用途
第一代	Sanger测序	~800 bp	低	验证、小片段
第二代（NGS）	Illumina（HiSeq/NovaSeq）	150 bp × 2	极高	WGS、WES、RNA-seq
第三代（长读长）	PacBio HiFi / Oxford Nanopore	10-100 kb	中高	结构变异、重复区域、组装

我记得刚入行那会儿，大家还在用Sanger做候选基因验证，一个样本只能看几个位点。现在的NGS，一个flowcell跑下来就是几百个样本的WES数据。嗯，这里要注意：读长越短，比对和变异检测的难度越大，尤其是在重复区域。

实践建议：在Biomarker发现项目中，我建议初期先用WES做探索，锁定候选区域后再用靶向NGS（Panel）做大样本验证。成本控制很重要，别一上来就全基因组。

2.2 突变类型概述——SNP、Indel、CNV

测序拿到了序列，接下来就是找差异。基因组突变，按照尺度从小到大，主要分三类：

2.2.1 SNP（单核苷酸多态性）

单个碱基的替换。这是最常见的突变类型。比如一个位点本来是A，在肿瘤样本里变成了T。

同义突变：不改变氨基酸——往往是“旁观者”
错义突变：改变氨基酸——可能影响蛋白功能
无义突变：提前引入终止密码子——通常致病性高

2.2.2 Indel（插入/缺失）

长度在1-50 bp左右的插入或缺失。Indel容易引起移码，破坏性比SNP更大。

我曾经在一个结直肠癌项目里发现一个2 bp的缺失，直接导致MSH2基因移码。如果不做Indel检测，单纯看SNP就会漏掉这个关键位点。

2.2.3 CNV（拷贝数变异）

大于1 kb的片段拷贝数增加（扩增）或减少（缺失）。

比如EGFR扩增在肺癌里很常见
PTEN缺失在前列腺癌里是关键事件

核心观点：SNP、Indel、CNV不是互相独立的。一个CNV的区域内部可以存在大量SNP，CNV断点附近也常有Indel。构建突变图谱时，这三种信号要联合解读，别孤立分析。

2.3 突变图谱构建的“标准”流程

我个人习惯把流程分成四步：质控→比对→变异检测→注释。每一步都有坑，我踩过的坑现在跟你说说。

2.3.1 原始数据质控

拿到FASTQ文件后，第一步一定是跑FastQC。我见过太多人直接跳过这步去比对，结果下游变异检测全是假阳性。

# 常用质控命令
fastqc sample_R1.fastq.gz sample_R2.fastq.gz -o qc_reports/

# 低质量碱基和接头修剪（推荐fastp）
fastp -i sample_R1.fastq.gz -I sample_R2.fastq.gz \
      -o cleaned_R1.fastq.gz -O cleaned_R2.fastq.gz \
      --cut_front --cut_tail --detect_adapter_for_pe

嗯，这里要注意：多组学整合项目里，DNA测序的质控标准要比RNA-seq更严。因为变异检测对碱基质量极其敏感，Q30比例建议高于85%。

2.3.2 比对到参考基因组

最常用的工具是BWA-MEM。比对后的BAM文件还要做标记重复（MarkDuplicates）和碱基质量重校准（BQSR）。

# BWA-MEM比对
bwa mem -t 8 -M hg38.fa sample_R1.fastq.gz sample_R2.fastq.gz > sample.sam

# SAM转BAM、排序、标记重复
samtools view -bS sample.sam | samtools sort -o sample_sorted.bam
picard MarkDuplicates I=sample_sorted.bam O=sample_dedup.bam M=metrics.txt

# GATK碱基质量重校准（BQSR）
gatk BaseRecalibrator -R hg38.fa -I sample_dedup.bam --known-sites dbsnp.vcf -O recal.table
gatk ApplyBQSR -R hg38.fa -I sample_dedup.bam --bqsr-recal-file recal.table -O sample_recal.bam

我曾经踩过的坑：BQSR这一步需要提供已知的sites（比如dbsnp）。如果你用了一个不完整的dbsnp版本，重校准后的数据反而更差。建议用GATK官方的bundle包，别随便从网上下载个老旧版本。

2.3.3 变异检测

对于SNP和Indel，当前的金标准是GATK HaplotypeCaller。CNV检测通常需要单独工具。

GATK HaplotypeCaller：联合检测SNP和Indel，通过局部重新组装获取更准确的的变异
Mutect2：肿瘤-正常配对样本的体细胞突变检测，会在GATK4里
CNVkit / GATK gCNV：专门用于CNV检测
Manta / Delly：用于检测结构变异（SV）

# GATK4 HaplotypeCaller 单样本模式
gatk HaplotypeCaller -R hg38.fa -I sample_recal.bam \
  -O sample.g.vcf.gz -ERC GVCF

# 联合基因分型（多样本时）
gatk CombineGVCFs -R hg38.fa -V sample1.g.vcf.gz -V sample2.g.vcf.gz -O cohort.g.vcf.gz
gatk GenotypeGVCFs -R hg38.fa -V cohort.g.vcf.gz -O raw_variants.vcf.gz

2.3.4 变异注释

VCF文件里只有位置和基因型，我们要问：“这个突变是错义吗？MAF多少？是否有已知致病性？”

我常用ANNOVAR或VEP来做功能注释，再用gnomAD / ClinVar 做群体频率和致病性标注。

# ANNOVAR 注释示例
table_annovar.pl raw_variants.vcf humandb/ \
  -buildver hg38 \
  -out annotated_variants \
  -remove -protocol refGene,exac03,clinvar_20240926 \
  -operation gx,f,f -nastring . -vcfinput

2.4 核心知识图谱——构建流程总览

我把上述流程画了一张图，方便你记忆整体脉络。这是一个端到端的构建流程：从FASTQ出发，到你可以直接用于多组学整合的注释后VCF。

2.5 构建突变图谱的注意事项

流程清楚了，我再唠叨几句实战中容易翻车的地方。

2.5.1 批次效应

我在一个大型队列项目（3000+样本）里处理过两台Illumina NovaSeq的测序数据。同样的样本被分到不同flowcell里跑，结果变异检测在某个基因区域出现明显的批次差异。

解决办法：变异检测阶段尽量用joint calling（联合基因分型），不要每个样本单独call完后合并。GATK的GenotypeGVCFs就是为此设计的。

2.5.2 过滤策略

VCF里原始变异很多是噪音。我习惯先用硬过滤（Hard Filtering）去除明显质量问题。

# GATK推荐SNP硬过滤脚本摘要
SNP_FILTER_EXPR="QD < 2.0 || MQ < 40.0 || FS > 60.0 || SOR > 3.0 || MQRankSum < -12.5 || ReadPosRankSum < -8.0"

一句话总结过滤原则：宁可漏掉1个真阳性，也不要留下3个假阳性。下游多组学整合时，假阳性的破坏力是几何级的。

2.5.3 多组学整合的结构化输出

我强烈建议把最终突变图谱组织成适合下游分析的格式。MAF（Mutation Annotation Format）是TCGA的标准，也是后续R包maftools、GenVisR直接能读入的格式。

比如一张MAF表格头几列大致是这样：

Hugo_Symbol	Chromosome	Start_Position	Variant_Classification	Variant_Type	Reference_Allele	Tumor_Seq_Allele2	t_depth	t_alt_count
TP53	17	7673802	Missense_Mutation	SNP	C	T	150	78
EGFR	7	55249071	In_Frame_Deletion	DEL	CTT	--	200	112

嗯，这一章差不多了。从DNA测序原理到突变类型，再到完整的构建流程和注意事项，我们已经搭建了突变图谱的骨架。下一块内容我们就要用这个骨架去和转录组、蛋白组做整合了。记住：干净的突变图谱，是一切多组学关联分析的起点。